摘要
线粒体是细胞稳态的核心，在衰老和年龄相关疾病中发挥关键作用，因此成为有前景的治疗靶点。本研究中，我们鉴定出特比萘芬和米格鲁特是新型线粒体应激诱导剂，能够延长秀丽隐杆线虫的寿命并改善健康寿命。通过两步筛选，我们发现这两种化合物均能激活线粒体应激反应（MSR），并表现出不同的作用机制。特比萘芬和米格鲁特强烈激活线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）中介物ATFS-1，上调MSR通路，并跨物种调节线粒体功能，与多西环素类似。有趣的是，这两种化合物在秀丽隐杆线虫中还涉及胰岛素/IGF-1信号（IIS）通路，揭示了一种整合应激反应，涉及ATFS-1和FOXO转录因子DAF-16的协同作用，与经典IIS激活不同。在人类HEK293T细胞中的实验证实了其转化潜力，这两种化合物在哺乳动物系统中诱导线粒体应激并调节线粒体功能。本研究强调了利用MSR促进长寿和减轻年龄相关功能衰退的潜力。特比萘芬和米格鲁特作为线粒体应激源的鉴定为新型抗衰老疗法铺平了道路。
1 引言
衰老的特征是功能逐渐衰退，以及对多种非传染性疾病（包括癌症、心血管和神经退行性疾病）易感性增加。目前的疗法仅处理症状，而未解决这些疾病的潜在病理生理学问题。随着全球老年人口预计到2050年将达到21亿（世界卫生组织），迫切需要促进健康老龄化的干预措施。
年龄相关疾病共有许多生物损伤，包括基因组不稳定性、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、营养感知失调、细胞衰老、干细胞耗竭、细胞间通讯改变和线粒体功能障碍（López-Otín等人，2023）。其中，线粒体功能障碍已成为衰老和疾病进展的关键驱动因素（Gorman等人，2016）。线粒体是参与多种细胞功能的重要细胞器，包括能量获取、生物发生、稳态调节和凋亡（Martínez-Reyes和Chandel，2020）。线粒体完整性的变化不仅影响细胞代谢，还关键地影响全身代谢、健康和寿命。因此，靶向线粒体的疗法在治疗代谢和年龄相关疾病方面引起了广泛关注。
一种有前景的方法是药理学诱导线粒体应激反应（MSR），这是一种恢复蛋白质稳态并增强对应激抵抗力的适应性通路。虽然严重的线粒体功能障碍是有害的，但轻度线粒体应激可以延长寿命并延缓年龄相关衰退，这种现象称为线粒体毒物兴奋效应（mitohormesis）（Mottis等人，2022）。诱导MSR的化合物在减轻年龄相关衰退和改善多种疾病结局方面显示出潜力（Mottis等人，2022；Romani等人，2021；Sorrentino等人，2017）。
MSR的一个关键组成部分是线粒体未折叠蛋白反应（UPRmt）（Durieux等人，2011），它协调细胞对线粒体应激的反应并维持线粒体蛋白质稳态。在秀丽隐杆线虫中，UPRmt由错误折叠蛋白触发，导致应激相关转录因子1（ATFS-1）的激活，从而诱导分子伴侣、蛋白酶和代谢调节因子以重建线粒体稳态（Jovaisaite等人，2014；Nargund等人，2012）。在哺乳动物中观察到类似机制，其中ATF4和ATF5介导线粒体应激反应（Mottis等人，2019）。值得注意的是，轻度线粒体扰动，包括线粒体核糖体蛋白敲低或抗生素治疗（如多西环素），可以激活UPRmt并延长秀丽隐杆线虫和其他物种的寿命（Houtkooper等人，2013）。多西环素诱导的MSR还被证明可改善阿尔茨海默病模型中的蛋白质稳态（Sorrentino等人，2017），改善肌肉淀粉样变性（Romani等人，2021），并提高致命性流感感染的存活率（Mottis等人，2022）。
除了线粒体毒物兴奋效应，胰岛素/IGF-1信号（IIS）通路是另一个关键的长寿调节因子（Zečić和Braeckman，2020）。在秀丽隐杆线虫中，IIS由胰岛素样肽与DAF-2结合触发，DAF-2是胰岛素/IGF-1受体的同源物。DAF-2的激活启动磷酸化级联反应，导致DAF-16失活，DAF-16是一种对抵抗应激和延长寿命至关重要的FOXO转录因子（Oh等人，2005）。相反，降低IIS导致DAF-16在细胞核中积累，从而促进长寿（Hsu等人，2003；Murphy和Hu，2013）。有趣的是，DAF-16也是长寿命线粒体突变体延长寿命所必需的（Senchuk等人，2018），表明MSR和IIS之间存在尚未完全理解的交互作用。
尽管衰老研究取得了进展，但很少有药物能够在不产生不良副作用的情况下强效激活MSR。虽然像多西环素这样的抗生素能强效诱导UPRmt，但它们的抗菌活性会破坏微生物组并导致抗生素耐药性，限制了其治疗潜力。因此，鉴定不具有抗菌特性的线粒体应激诱导剂至关重要。
在这里，我们筛选了770种FDA批准药物，以鉴定新型MSR激活剂。利用秀丽隐杆线虫，我们鉴定出特比萘芬和米格鲁特是线粒体应激调节剂，可延长寿命和健康寿命，且无抗菌活性。在机制上，这两种化合物均激活UPRmt并涉及DAF-16依赖的IIS信号，其激活方式与经典方式不同，揭示了一种协调的应激适应程序。重要的是，特比萘芬和米格鲁特还能在人类细胞中诱导线粒体应激反应，支持其转化相关性，并突显了靶向线粒体功能障碍在衰老中的新机遇。
2 结果
2.1 全面筛选鉴定出特比萘芬和米格鲁特是新型线粒体应激调节剂，可增强寿命和健康寿命
为了鉴定新型MSR激活化合物，我们筛选了770种FDA批准药物，使用了秀丽隐杆线虫报告菌株hsp-6p::gfp，该菌株主要反映通过ATFS-1的UPRmt激活（图1A）。化合物在100 μM或50 μM（如果观察到毒性）下进行测试。我们鉴定出69个阳性结果（abs(Z) > 1.96；图1B），并优先选择了前20个（Z > 3.5；图1C），包括已知的UPRmt激活剂（四环素类），验证了筛选的有效性。由于四环素类对健康寿命的作用机制已明确，因此将其排除在进一步分析之外（Houtkooper等人，2013；Mottis等人，2022）。有趣的是，其余18种化合物涵盖多种治疗类别，包括抗炎、抗真菌、心血管、神经精神和抗过敏药物（表S1），突显了能够调节线粒体功能的药理学干预的广泛范围。
轻度线粒体扰动可通过毒物兴奋效应促进长寿（Lima等人，2022）。然而，过度应激可能有害，强调鉴定在有益毒物兴奋效应窗口内作用的化合物的重要性（Lima等人，2022）。为了确定足以诱导MSR同时限制潜在毒性的浓度，我们使用hsp-6p::gfp报告菌株进行了剂量滴定，并验证了13种化合物（图S1）。为了评估它们对长寿2.1 综合筛选鉴定出特比萘芬和米格鲁特是新型线粒体应激调节剂，可增强寿命和健康寿命（续）
为了评估它们对长寿的影响，我们测试了每种化合物的两个浓度：滴定过程中能诱导MSR激活的最低剂量，以及一个较低浓度以减轻长期暴露的潜在毒性。
寿命分析显示化合物之间存在显著差异（图1E和图S2，表S2）。七种化合物缩短了寿命，四种无显著影响，而两种化合物显著延长了寿命。
特比萘芬是一种抑制角鲨烯环氧化酶的抗真菌药物，其平均寿命延长了9.2%（31.25 μM；风险比=-0.62，p<0.001）和7.3%（15 μM；风险比=-0.52，p<0.01）。米格鲁特是一种葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂，在250 μM浓度下将平均寿命延长了5.5%（风险比=-0.50，p<0.01）；其500 μM浓度的效果较弱（2.6%，风险比=-0.25，p=0.16）。
衰老通常伴随肌肉减少症，即肌肉质量和功能的进行性丧失，这会导致虚弱和生活质量下降（Beaudart等人，2023）。为了评估健康寿命，我们测量了秀丽隐杆线虫中与年龄相关的瘫痪（第20-25天），这是肌肉衰退的标志（Statzer等人，2022）。两种化合物均减少了瘫痪，特比萘芬最大减少量为60%，米格鲁特约为40%（图1F）。
许多UPRmt诱导剂的一个关键限制是其抗菌活性，这限制了其治疗潜力。相比之下，特比萘芬和米格鲁特在我们的实验条件下未显示出对大肠杆菌OP50的可检测抗菌活性（图1G）。此外，长期治疗不影响体型或产卵能力（图S3），这与多西环素的效果不同。这些发现表明，观察到的寿命和健康寿命改善不太可能是由发育或生殖缺陷驱动的。这使得特比萘芬和米格鲁特有别于许多先前鉴定的线粒体毒物兴奋效应剂，并突显了它们在衰老和年龄相关疾病中的转化应用潜力。
2.2 特比萘芬和米格鲁特激活的线粒体应激反应与多西环素相似
为了深入了解特比萘芬和米格鲁特促进长寿的机制，我们对第1日成虫进行了转录组分析。多西环素诱导了广泛的转录变化（6908个基因上调，7082个基因下调），而特比萘芬和米格鲁特引发了更针对性的反应（分别有120和105个基因上调，53和26个基因下调；图2A-B）。尽管幅度存在这些差异，但上调基因与多西环素显示出大量重叠（特比萘芬为67%，米格鲁特为80%）（图2A），表明特定通路被共同激活。相比之下，下调基因的重叠较少（分别为17.8%和18.2%）（图2B）。有趣的是，有11个基因在所有处理中均被一致诱导，并且富集于脂肪酸代谢和蛋白质稳态，包括线粒体蛋白酶lonp-2（表S3）。
为了更好地表征特比萘芬和米格鲁的特异性，我们还探索了每种化合物特异性上调的基因（表S4-S6）。特比萘芬特异性基因揭示了与氧化剂解毒、单加氧酶活性和蛋白质稳态调节相关的通路，反映了其在促进蛋白质质量控制以及防止氧化损伤方面的作用（表S4）。
有趣的是，特比萘芬和米格鲁特共享三个未被多西环素诱导的上调基因，这些基因与脂肪酸α-氧化和过氧化物酶体功能相关（表S6）。这些通路的共同上调表明，两种化合物均增加了脂质代谢和过氧化物酶体应激反应，这可能有助于其长寿效应。总体而言，该分析将特比萘芬和米格鲁特鉴定为新型UPRmt诱导剂，可促进细胞和代谢适应。
为了进一步探讨这些转录变化的功能含义，我们进行了基因集富集分析（GSEA）。与多西环素类似，特比萘芬和米格鲁特均下调了与线粒体功能和翻译相关的基因（图2C-E）。功能性的线粒体读数支持了这一转录反应。两种化合物均降低了基础呼吸和最大呼吸以及ATP水平（图2F-H）。特比萘芬降低了线粒体活性氧（mtROS）水平，而米格鲁特适度增加了mtROS（图2I），表明存在化合物特异性的应激特征。转录分析和使用mtRosella报告基因的体内评估均未显示线粒体自噬增加（图S4A-D），这反驳了线粒体周转是观察到的效应驱动因素的观点。重要的是，使用myo-3p::mtGFP报告菌株评估的线粒体含量未发生变化（图2J）。总之，这些数据表明，特比萘芬和米格鲁特诱导的线粒体应激以线粒体功能降低为特征，但不改变线粒体丰度。
2.3 特比萘芬和米格鲁特调节ATFS-1的表达及其转录反应
UPRmt是响应线粒体应激的核心保护性反应，由转录因子ATFS-1协调（Nargund等人，2015），并且与多西环素的线粒体毒物兴奋效应有关（Houtkooper等人，2013）。为了确定ATFS-1在特比萘芬和米格鲁特效应中的作用，我们使用了表达GFP标记的ATFS-1（受内源性atfs-1启动子控制）的秀丽隐杆线虫菌株。与先前的研究一致（Kaufman和Crowder，2015；Nargund等人，2012），多西环素强效增加了ATFS-1水平（约3.7倍）。特比萘芬也提高了总ATFS-1表达，尽管程度较小（约1.7倍）。同样，米格鲁特导致ATFS-1水平适度增加（图3A,B）。
为了进一步验证ATFS-1和UPRmt通路的激活，我们检查了已发表的RNA-seq和ChIP-seq数据集（Nargund等人，2015），这些数据集描述了线粒体应激条件下ATFS-1的活性。分析显示，三种化合物处理后，ATFS-1靶基因的表达均适度增加，其中多西环素引起的反应最强，其次是特比萘芬和米格鲁特（图3C）。鉴于线粒体应激与翻译调控之间的联系，我们还研究了线粒体和胞质翻译相关基因的表达。多西环素强烈抑制了线粒体翻译基因相对于胞质翻译基因的表达。相比之下，特比萘芬对线粒体翻译基因的抑制较为温和，而米格鲁特对线粒体与胞质翻译基因表达之间的平衡没有影响（图3D,E）。总之，这些发现证实了两种化合物均触发了更广泛MSR中的经典UPRmt分支，尽管程度低于多西环素。这表明特比萘芬和米格鲁特可能还通过经典UPRmt激活之外的额外调节机制来延长寿命和改善健康寿命。
2.4 多种应激反应通路有助于特比萘芬和米格鲁特的效应
为了进一步解析特比萘芬和米格鲁特效应的机制，我们使用HOMER对上调基因进行了转录因子基序富集分析（图4A，图S5A）。多西环素上调的基因富集了GATA转录因子（PQM-1、ELT-2、ELT-3）、缺氧诱导因子HIF-1、ATFS-1、HSF-1和DAF-16的基序。特比萘芬诱导的基因显示出对GATA转录因子、ATF-7、DAF-16和HSF-1基序的类似富集，而受米格鲁特影响的基因则富集了GATA转录因子、ATF-7、HIF-1和DAF-16的基序。
线粒体完整性（atfs-1）、热休克（hsf-1）、缺氧（hif-1）和胰岛素/IGF-1信号（daf-16）代表了主要的细胞应激反应通路，它们激活保护性基因以维持细胞和线粒体稳态（Zečić和Braeckman，2020）。蛋白质-蛋白质相互作用分析揭示了一个以DAF-16为中心的调控网络，表明多种应激反应通路通过激活保护性基因来维持线粒体功能和整体细胞稳态，从而进行协调调控（图4B和图S5B-D）。
鉴于这些应激反应之间复杂的相互作用，为了区分它们对化合物效应的个体贡献，我们从已发表的数据集生成了热休克、缺氧和IIS反应的基因特征。热休克反应通路受HSF-1调控，响应蛋白质错误折叠和线粒体功能障碍，导致热休克蛋白（HSPs）表达增加（Williams等人，2020）。利用已发表的关于热应激对秀丽隐杆线虫基因表达影响的转录组数据（Brunquell等人，2016），我们构建了一个热休克应激反应特征，包括最显著上调和下调的基因。对该特征的分析表明，只有多西环素激活了该通路，表现为热休克诱导基因表达增加和热休克抑制基因表达降低（图4C）。相比之下，特比萘芬和米格鲁特对热休克反应基因没有影响。与此一致，在对照条件下，特比萘芬和米格鲁特均未在体内诱导热休克报告基因hsp-16.2p::GFP（图S6A）。
接下来，我们研究了缺氧应激反应通路，因为多西环素和米格鲁特处理条件下富集了HIF-1基序。由HIF-1协调的缺氧应激反应是包括秀丽隐杆线虫在内的各种生物体中的关键适应性机制，确保细胞在低氧条件下的存活。利用已发表的秀丽隐杆线虫在缺氧条件下的转录组数据集（Vora等人，2022），我们构建了一个HIF-1基因特征，同样，尽管HIF-1基序富集，但我们发现任何化合物均未一致激活该通路（图4D）。体内使用缺氧报告基因nhr-57p::GFP进一步支持了这一点，该报告基因在对照条件下所有处理中均保持不变（图S6B）。
最后，鉴于所有三种化合物处理均富集了DAF-16基序，我们检查了胰岛素/IGF-1信号（IIS）通路，这是长寿的主要决定因素（Zečić和Braeckman，2020）。降低IIS与多种物种的寿命延长有关，包括秀丽隐杆线虫（Kenyon等人，1993）、黑腹果蝇（Clancy等人，2001）、小家鼠（Blüher等人，2003）以及人类，其中患有Laron综合征的个体尽管存在生长激素（GH）-胰岛素样生长因子-1（IGF1）缺乏，但显示出增强的保护性通路（Werner和Laron，2023）。有趣的是，DAF-16也被认为是长寿命线粒体突变体clk-1、isp-1和nuo-6中寿命延长的下游介质（Senchuk等人，2018），表明其在各种线粒体应激条件下发挥作用。为了进一步探讨DAF-16介导的长寿效应，我们使用了已发表的数据集，该数据集根据其表达模式将其靶基因分为两类。I类基因与应激抵抗和长寿相关，而II类基因参与生长和发育，通常被下调以促进长寿（Murphy等人，2003；Tepper等人，2013）。我们发现，特比萘芬和米格鲁特处理一致地上调了I类基因并下调了II类基因，表明存在促长寿的转录谱。然而，多西环素对这些基因类别表现出可变效应，表明它不以相同方式参与IIS通路（图4E）。使用daf-16p::daf-16a/b::GFP报告菌株的直接体内可视化证实了这一发现，特比萘芬和米格鲁特分别诱导了64%和70%处理动物的DAF-16核转位，而对照组为28%（图4F）。
最后，为了补充基于转录组的推断，我们评估了其他应激报告基因。特比萘芬适度增加了sod-3p::GFP荧光，表明适度激活了氧化应激防御，而两种化合物均未激活内质网应激报告基因hsp-4p::GFP（图S6C,D）。
总之，这些数据表明，特比萘芬和米格鲁特除了线粒体应激信号外，还涉及IIS/DAF-16，而多西环素主要激活经典UPRmt。
2.5 特比萘芬和米格鲁特突显了线粒体应激反应中ATFS-1和DAF-16之间的复杂相互作用
为了测试ATFS-1和DAF-16是否是特比萘芬和米格鲁特促长寿效应所必需的，我们在atfs-1(gk3094)、daf-16(mu86)和daf-2(e1370)突变体中进行了寿命测定。在所有三种遗传背景中，两种化合物均未延长寿命（图S7A-J；表S7），表明ATFS-1和DAF-16都是其有益效应所必需的。
与多西环素（其寿命延长效应主要局限于ATFS-1依赖的UPRmt激活（Houtkooper等人，2013；Wu等人，2018））不同，特比萘芬和米格鲁特同时涉及线粒体应激信号和IIS信号。这种双重需求表明存在一种更整合的应激反应。这种相互作用与长寿命线粒体突变体中的观察结果一致，其中两种转录因子都是延长寿命所必需的（Senchuk等人，2018；Wu等人，2018）。
虽然ATFS-1已被证明可促进DAF-16核定位，但我们发现DAF-16在药理学应激下也支持ATFS-1的激活。敲低daf-16降低了经特比萘芬、米格鲁特或多西环素处理的动物中ATFS-1的水平（图S8A-D）。具体而言，daf-16敲低导致多西环素下ATFS-1水平降低31%，特比萘芬下降低22%，米格鲁特下降低9%，表明DAF-16在多种环境中促进ATFS-1表达。相反，atfs-1敲低损害了特比萘芬和米格鲁特处理动物中DAF-16的核定位，分别降至55%和19%（图S8E-G），但在多西环素处理下则不然（增至63%），表明这两种因子之间存在应激源特异性的相互作用。
最后，我们询问了经典IIS抑制是否足以激活ATFS-1。对daf-2进行RNA干扰诱导了核ATFS-1的适度增加（约2倍）（图S9A,B）。然而，atfs-1敲低并未阻止IIS抑制下DAF-16的核定位（图S9C），表明ATFS-1不是经典DAF-16激活所必需的。
总之，这些数据支持一个模型，其中药理学线粒体应激涉及ATFS-1和DAF-16之间双向且依赖上下文的调节环路，这与经典IIS信号不同。
2.6 特比萘芬和米格鲁特在人类细胞中诱导线粒体应激并激活整合应激反应
为了评估我们发现的治疗潜力，我们研究了特比萘芬和米格鲁特对人胚胎肾293T（HEK293T）细胞中线粒体和细胞应激反应的影响。RT-qPCR分析显示，特比萘芬强效上调了与UPRmt相关的基因，而米格鲁特对线粒体应激相关基因表达无显著影响（图5A）。这种差异性的基因表达在蛋白质水平上得到了反映，特比萘芬诱导了关键应激反应因子ATF4、ATF5、C/EBP同源蛋白（CHOP）和线粒体应激蛋白ASNS的表达（图5B-G）。相比之下，米格鲁特选择性地上调了ATF5，对其他应激反应蛋白影响甚微（图5B-G）。
有趣的是，转录因子，特别是ATF4和CHOP，是整合应激反应（ISR）的核心介质（Costa-Mattioli和Walter，2020；Quirós等人，2017），这是一种由各种细胞应激源（包括线粒体功能障碍）激活的保守适应性通路。ISR的核心是真核翻译起始因子2α（eIF2α）的磷酸化，这会减少整体蛋白质合成，同时选择性地促进应激反应基因的翻译。值得注意的是，这些因子也参与内质网（ER）应激反应，由内质网中错误折叠蛋白的积累触发。为了确定内质网应激是否参与特比萘芬或米格鲁特的作用机制，我们检查了内质网特异性分子伴侣BiP-GRP78（免疫球蛋白重链结合蛋白，BiP）的表达（Costa-Mattioli和Walter，2020；Mottis等人，2019）。两种化合物均未改变BiP-GRP78的水平，表明内质网应激不是其机制的重要组成部分（图S10）。
为了进一步表征特比萘芬和米格鲁特对线粒体功能的影响，我们测量了HEK293T细胞中的细胞ATP水平并进行了呼吸测定分析。两种化合物均导致ATP水平呈两种化合物均导致ATP水平呈剂量依赖性降低（图5H,I），显著降低了基础和最大呼吸速率（图5J），并增加了线粒体ROS的产生（图5K）。这些发现表明，特比萘芬和米格鲁特诱导线粒体功能障碍和氧化应激，与其激活线粒体应激通路的作用一致。总体而言，我们的结果提供了证据，证明特比萘芬和米格鲁特作为线粒体应激源的作用在从秀丽隐杆线虫到人类细胞等物种中具有保守性。
2.7 特比萘芬诱导线粒体核蛋白失衡，与多西环素采用的机制相似
我们已经确定了特比萘芬和米格鲁特在人类细胞中激活MSR和ISR。尽管在蠕虫中对线粒体翻译的影响很微弱，但我们研究了这些化合物是否影响线粒体翻译，这是线粒体蛋白质稳态的关键决定因素。在HEK293T细胞中，氧化磷酸化（OXPHOS）复合物亚基的蛋白质印迹分析显示，特比萘芬处理破坏了核编码与线粒体编码（nuDNA/mtDNA编码）的OXPHOS蛋白比例，表明存在线粒体核蛋白失衡（图6A-E）。这种失衡是MSR激活的标志（Houtkooper等人，2013），与多西环素诱导的失衡程度相当，而米格鲁特的影响较弱。线粒体含量或mtDNA编码的转录本水平均未发生广泛改变，表明这种失衡反映了线粒体翻译受损，而非线粒体丰度的变化（图6F,G）。我们将特比萘芬引起MT-CO1（线粒体编码的细胞色素c氧化酶亚基1）mRNA水平的增加（图6G）解释为对MT-CO1蛋白质水平急剧降低的补偿性反应（图6A,B）。
特比萘芬与多西环素的相似性值得注意，因为多西环素是一种特征明确的线粒体翻译抑制剂。它破坏线粒体核糖体功能，诱导线粒体核蛋白失衡，并激活MSR，从而延长秀丽隐杆线虫的寿命。我们的发现表明，特比萘芬可能通过类似的机制发挥作用，可能靶向线粒体翻译机制。
为了探讨这一假设，我们使用连接图谱（CMap）数据库（Subramanian等人，2017）进行了比较转录组学分析，该数据库包含来自5000种小分子和3000种遗传扰动在多种人类细胞系中的超过150万个基因表达谱。特比萘芬的基因表达特征与已确定的UPRmt诱导剂多西环素和四环素的特征有63.6%的重叠（图6H,I）。值得注意的是，特比萘芬与细菌30S核糖体亚基抑制特征显示出惊人的相似性（图6H）。这些结果提供了额外的证据，表明特比萘芬可能像多西环素和四环素一样，通过抑制线粒体翻译诱导线粒体核蛋白失衡，从而延长健康寿命和寿命。
通过破坏线粒体核蛋白稳态，特比萘芬可能激活MSR，这为其延长健康寿命和寿命的效应提供了潜在机制。
3 讨论
衰老是一个日益严峻的全球健康挑战，目前的治疗通常针对症状而非根本原因。在这里，我们鉴定出两种FDA批准药物，特比萘芬和米格鲁特，是新型线粒体应激调节剂，可延长寿命和健康寿命。尽管这两种化合物都能促进长寿，但我们的数据表明，它们涉及部分重叠但机制上不同的应激适应程序，突显了线粒体毒物兴奋效应调控的复杂性。
特比萘芬是一种靶向角鲨烯环氧化酶（SQLE）的抗真菌药物，通过ATFS-1强效激活UPRmt，并破坏线粒体翻译，类似于多西环素的作用机制。相比之下，目前用于治疗溶酶体贮积症的米格鲁特对ATFS-1的激活较为温和。两种化合物还激活了胰岛素/IGF-1信号（IIS）通路，证据是DAF-16核转位和IIS靶基因的调控。相比之下，多西环素的效应仅限于通过ATFS-1激活UPRmt。
我们的发现支持IIS和MSR通路之间的功能性相互作用。虽然ATFS-1已被证明可促进DAF-16核定位（Wu等人，2018），但我们发现，在药理学应激下，DAF-16可以反过来促进ATFS-1的激活。这与经典的IIS抑制不同，在经典IIS抑制中，FOXO/DAF-16的激活先于线粒体重塑，并且不需要ATFS-1。
总之，这些观察结果表明，线粒体毒物兴奋效应化合物可以涉及一种非经典的信号序列，其中线粒体扰动本身有助于FOXO激活，揭示线粒体与IIS通路之间双向且依赖上下文的相互作用，并为线粒体应激如何主动参与IIS/FOXO以促进长寿提供了机制框架。
除了ATFS-1和DAF-16，转录因子基序分析还揭示了其他应激响应调节因子的富集，包括GATA转录因子和PQM-1。鉴于它们在秀丽隐杆线虫应激抵抗和长寿中已确立的作用（Li等人，2025），这些发现支持一个模型，其中线粒体毒物兴奋效应延长的寿命依赖于一个协调的转录程序，而非单一的主调控因子。
特比萘芬和米格鲁特在人类细胞中的效应进一步支持了它们的治疗潜力。在HEK293T细胞中，特比萘芬激活了关键的应激调节因子，损害了线粒体呼吸，并增加了ROS的产生，而米格鲁特的影响更微妙，选择性地激活ATF5和线粒体功能。比较转录组学揭示了特比萘芬与已知的线粒体翻译抑制剂（如多西环素）之间的强烈相似性，表明特比萘芬可能通过与多西环素类似的机制发挥作用。这些发现得到了线粒体核蛋白失衡（线粒体翻译抑制的标志）证据的进一步支持。不幸的是，可用数据的局限性限制了我们为米格鲁特进行类似探索的能力。
一个重要的未解决问题是，在秀丽隐杆线虫中观察到的线粒体应激信号与FOXO活性之间的相互作用在哺乳动物中是否保守。虽然两种化合物都在人类细胞中诱导了线粒体应激反应，但未直接评估FOXO信号。确定线粒体扰动是否能在哺乳动物中类似地涉及FOXO依赖的适应性程序，是未来研究的一个重要方向。
最后，我们的研究突显了鉴定线粒体毒物兴奋效应化合物的前景和挑战。许多最初的阳性结果因毒性而未能延长寿命，强调了有益应激反应所需的微妙平衡。此外，手动剂量反应限制了对毒物兴奋效应范围的全面探索，表明自动化的剂量反应和转录组学指导的方法可以提高未来筛选的精确度。尽管在延长寿命的浓度下，在蠕虫或HEK293T细胞中未观察到显著毒性，但向哺乳动物模型的转化将需要仔细的剂量优化和安全性监测，特别是考虑到特比萘芬和米格鲁特已知的副作用特征。此外，虽然两种化合物在我们的实验条件下均未抑制标准食物大肠杆菌OP50的生长，但未来的工作应测试更广泛的共生菌群，以完全排除意外的抗菌效应和潜在的微生物组扰动。
总之，特比萘芬和米格鲁特作为新型线粒体应激调节剂的鉴定，为开发对抗衰老的新治疗策略提供了有希望的机遇。它们的FDA批准状态，加上在我们的实验中缺乏显著的抗菌活性，使它们成为临床应用特别有吸引力的候选药物。此外，我们关于多种应激反应通路整合的发现，为对抗年龄相关疾病和促进健康老龄化提供了新的治疗方向。
4 材料与方法
4.1 化学试剂
Screen-Well FDA批准药物库V2购自Enzo Life Sciences（比利时布鲁塞尔）。多西环素（Dox；Cat. D9891）购自Sigma-Aldrich（荷兰兹瓦恩德雷赫特），特比萘芬（BML-EI318-0100）和米格鲁特（BML-SL230-0025）购自Enzo Life Sciences。
4.2 秀丽隐杆线虫菌株及两步筛选过程的蠕虫收集
蠕虫菌株由Caenorhabditis遗传学中心（明尼苏达大学）提供。菌株SJ4100（zcIs13[hsp-6::GFP]）用于筛选。N2、atfs-1(gk3094)、daf-16(mu86)和daf-2(e1370)用于寿命测定。OP675（atfs-1p::atfs-1::FLAG::GFP）、TJ356（daf-16p::daf-16a/b::GFP）、SJ4103（myo-3p::mtGFP）、ZG120（unc-119(ed3) III; iaIs7 IV., [nhr-57p::GFP + unc-119(+)]）、ZG119（unc-119(ed3) III; iaIs7 IV; vhl-1(ok161) X., [nhr-57p::GFP + unc-119(+)]）、CF1553（sod-3p::GFP）、SJ4005（hsp-4::gfp）、CL2070（hsp-16.2p::GFP）以及线粒体自噬生物传感器IR2539 [unc-119(ed3); Ex[pmyo-3::TOMM-20::Rosella; unc-119(+)]] 用于基于成像的测定（Palikaras等人，2015）。
4.3 秀丽隐杆线虫的化合物处理
对于筛选，从卵孵化到年轻成虫（3天），蠕虫在铺有E. coli HT115的12孔板上处理。药物以100 μM或50 μM（如果观察到毒性）施用于板表面（含2 mM IPTG、25 mg/mL羧苄青霉素、10 μM 5-FU）。每批实验包括50 μM多西环素的阳性对照和1% DMSO的阴性对照。方案旨在确保DMSO浓度不超过1%。对于寿命测定，从L1幼虫期到成年期给予化合物。将处理补充到板表面（含2 mM IPTG、25 mg/mL羧苄青霉素和10 μM 5-FU）。特比萘芬（31.5 μM）、米格鲁特（250 μM）和多西环素（50 μM）同样用于化合物表征。
4.4 寿命和健康寿命测量
寿命测定在20°C下进行，如前所述（Mouchiroud等人，2011），每两天对每个条件的60-80条蠕虫进行评分。瘫痪评估如前所述（Leiteritz等人，2020）。
4.5 线粒体应激筛选图像采集和分析
第1日成年蠕虫用7.5 mM四咪唑盐酸盐（Cat. T1512, Sigma）固定，并使用Nikon SMZ1000显微镜成像。使用FIJI/ImageJ定量GFP信号。数值归一化，Z分数计算如下：Z_score_k = (μ_k - μ_DMSO) / σ_DMSO，其中μ_K和μ_DMSO分别代表化合物处理和对照蠕虫的平均荧光强度。σ_DMSO是对照组的标准差。
4.6 秀丽隐杆线虫中的GFP定量和共聚焦成像
为了评估线粒体含量，我们使用了SJ4103（zcIs14[myo-3p::mtGFP]）蠕虫。蠕虫从L1期处理到第1日成虫，然后收集并转移到96孔板（每孔10-15只动物）。使用SpectraMax iD3读板器（Molecular Devices）测量GFP强度，并归一化至蠕虫数量。对于OP675和TJ356的共聚焦成像，用10 mM四咪唑固定蠕虫，并安装在2%琼脂糖垫上。使用Leica SP8共聚焦显微镜捕获图像。使用mtRosella生物传感器菌株IR2539评估线粒体自噬（Palikaras等人，2015）。使用Leica DM5500荧光显微镜对蠕虫成像，线粒体自噬水平定量为pH不敏感的DsRed信号与pH敏感的GFP信号的比率。
4.7 细菌生长试验
大肠杆菌OP50在含有化合物的LB（Luria-Bertani）培养基中于37°C培养。使用SpectraMax iD3读板器每1小时测量600 nm的光密度（OD 600），持续8小时，以评估生长情况。
4.8 用于RNA测序的蠕虫样本收集
处理L1幼虫（每个条件约3000条蠕虫），在第1日成虫期收集，洗涤，并在液氮中速冻。每个条件收集四个生物学重复。
4.9 秀丽隐杆线虫RNA提取和RNA-Seq数据分析
使用TriPure分离试剂（Cat. 11667165001, Roche）提取RNA。然后将样品冻融八次以破坏细胞膜。然后使用基于柱的RNA提取试剂盒（Macherey-Nagel试剂盒，Cat. 740955.250）提取RNA，并在北京基因组研究所（BGI）的BGISEQ-500平台上进行测序。使用FastQC（fastqcr，版本0.11.7）检查比对质量，并使用STAR（v2.73a）将读数比对到“C. elegans WBcel235.89”基因组。使用DEseq2（v1.40.2）（Love等人，2014）进行差异基因表达分析。使用clusterProfiler（v42.2）（Yu等人，2012）进行基因集富集分析（GSEA）。富集使用最小基因集大小为1，最大基因集大小为5000，并执行100,000次置换。
4.10 转录因子富集分析
使用HOMER（v4.11）（Duttke等人，2019）对差异表达基因（abs(log2FC) > 0.5，调整后p值 < 0.05）进行基序富集分析。使用findMotifs.pl（起始：-500 bp；结束：500 bp）针对来自HOMER的已知基序库和从JASPAR数据库下载的数据进行从头基序发现。
4.11 秀丽隐杆线虫中的线粒体耗氧量、ATP、ROS测量
使用Seahorse XF96（Agilent Technologies）测量耗氧率（OCR）。处理100-150条L1蠕虫，在第1日成虫期收集，洗涤并转移到Seahorse板（每孔5-10条蠕虫）。在注射10 μM FCCP后评估最大OCR，并归一化至蠕虫计数。通过用MitoTracker Red CM-H2XROS（Molecular Probes, Invitrogen; M7513）染色动物来评估线粒体活性氧（mtROS）水平，而使用BioTracker ATP-Red活细胞染料（Merck; SCT045）测量线粒体ATP水平。将两种染料在M9缓冲液中稀释，并以最终浓度0.15 μM（MitoTracker Red CM-H2XROS）和0.8 μM（BioTracker ATP-Red）添加到预铺有蠕虫生长培养基（NGM）的板表面。
4.12 细胞培养和药物处理
HEK293T细胞（Cat. CRL-3216, ATCC）在DMEM（4.5 g/L葡萄糖，10% FBS）中于37°C、5% CO2条件下培养。用多西环素（33.75 μM—15 μg/mL）、特比萘芬（100 μM）或米格鲁特（500 μM）处理细胞24小时。
4.13 细胞RNA提取和RT-qPCR
用1 mL TriPure分离试剂（Cat. 11667165001, Roche）提取总RNA，并使用Macherey-Nagel RNA试剂盒纯化。使用Qiagen逆转录试剂盒（Cat. 205314）合成cDNA，并使用LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂盒（Cat. 04887352001, Roche）进行RT-qPCR。引物序列见支持信息（表S8）。表达值归一化至GAPDH。
4.14 HEK293T细胞中的线粒体呼吸和ATP测量
使用Seahorse分析仪XF96测量OCR，评估基础呼吸、最大呼吸和非线粒体呼吸（2 μM Oligomycin, 2 μM FCCP, 1 μM Rotenone/Antimycin）。OCR值归一化至DNA含量（Hoechst染色）。使用CellTiter-Glo（Promega）定量ATP水平，使用SpectraMax iD3记录发光，并归一化至蛋白质含量（Lowry测定）。
4.15 HEK293T细胞中线粒体ROS定量
使用MitoSox（Cat. M36008, Thermofisher）测量线粒体ROS水平。将细胞与1 μM MitoSox在37°C下孵育30分钟，洗涤两次，用冷PBS脱附，并通过流式细胞术（FlowJo LLC）分析。
4.16 HEK293T细胞中的蛋白质印迹
如前所述进行蛋白质印迹（Benegiamo等人，2023）。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（Roche/Thermo Fisher Scientific）的RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% Na-脱氧胆酸盐, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, 50 mM NaF）裂解细胞。通过Lowry测定法定量蛋白质。在3-(N-吗啉代)丙磺酸-SDS电泳缓冲液中，于200 V下进行凝胶电泳1小时。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上（100 V，2小时，冰上）。在5%牛奶/TBST中封闭1小时，并在4°C下与一抗（见支持信息，表S9）孵育过夜。用Tris缓冲盐水和Tween 20溶液洗涤三次后，根据所用抗体，将膜与HRP标记的抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗孵育。使用FIJI/ImageJ定量图像，并归一化至Ponceau染色。
作者贡献
概念构思：Amélia Lalou, Arwen W. Gao, Johan Auwerx。数据分析：Amélia Lalou。方法学：Amélia Lalou, Sandra Rodríguez-López, Arwen W. Gao, Terytty Yang Li, Qi Wang。实验研究：Amélia Lalou。研究协助：Ioanna Daskalaki, Ilias Gkikas, Sandra Rodríguez-López,研究协助：Ioanna Daskalaki, Ilias Gkikas, Sandra Rodríguez-López, Adrien Faure, Joaquim Barmaz, Arwen W. Gao, Feng Gao, Danaé Broustail。写作 - 初稿：Amélia Lalou, Jean-David Morel, Giorgia Benegiamo, Johan Auwerx。写作 - 审阅和编辑：所有作者。资金获取：Johan Auwerx, Kristina Schoonjans, Giovanni D'Angelo。监督指导：Johan Auwerx。
致谢
我们感谢 B. Kim Conzelmann, A. Jalil, S. Bichet, S. Tatli, H. Liu 和 A. Badreddine 的支持。我们感谢 J. Auwerx 和 K. Schoonjans 实验室所有成员进行讨论。我们感谢 Caenorhabditis 遗传学中心提供秀丽隐杆线虫菌株，以及 Tavernarakis 实验室（希腊 IMBB）慷慨提供 mtRosella 生物传感器 IR2539（Palikaras 等人，2015）。我们感谢洛桑联邦理工学院（J.A.）、欧洲研究委员会（ERC-AdG-787702）、瑞士国家科学基金会（SNSF 31003A_179435 和 Sinergia CRSII5_202302）以及韩国国家研究基金会 GRL 资助（NRF 2017K1A1A2013124）的资助。S.R.-L. 受欧洲分子生物学组织（ALTF 67-2022）资助。T.Y.L. 受“人类前沿科学计划”（LT000731/2018-L）资助。Q.W. 受 EMBO（ALTF 111-2021）资助。A.W.G. 受美国线粒体疾病基金会（PF-19-0232）、阿姆斯特丹 UMC 博士后职业桥接基金、Horizon-MSCA-PF-EF-2022（101108082）和 AGEM 人才发展基金（2023）资助。作者感谢 OpenAI 在稿件准备过程中协助进行英语语言编辑、语法和词汇精炼。开放获取出版由洛桑联邦理工学院通过 Wiley - 洛桑联邦理工学院协议（经由瑞士学术图书馆联盟）资助。
资助
我们感谢洛桑联邦理工学院（J.A.）、欧洲研究委员会（ERC-AdG-787702）、瑞士国家科学基金会（SNSF 31003A_179435 和 Sinergia CRSII5_202302）以及韩国国家研究基金会 GRL 资助（NRF 2017K1A1A2013124）的资助。S.R.-L. 受欧洲分子生物学组织（ALTF 67-2022）资助。T.Y.L. 受“人类前沿科学计划”（LT000731/2018-L）资助。Q.W. 受 EMBO（ALTF 111-2021）资助。A.W.G. 受美国线粒体疾病基金会（PF-19-0232）、阿姆斯特丹大学医学中心（Amsterdam UMC）博士后职业桥接基金、欧盟委员会地平线欧洲计划（MSCA-PF-EF-2022, 101108082）以及阿姆斯特丹 UMC AGEM 人才发展基金（2023）资助。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在 NCBI 基因表达综合数据库（GEO）中公开获取，参考编号 GSE290712。
支持信息
文件名：acel70452-sup-0001-Figures.pdf，PDF文档，243.3 MB
描述：图 S1 至 S10 及相关说明。
文件名：acel70452-sup-0002-Tables.docx，Word 2007 文档，37.8 KB
描述：表 S1 至 S9 及相关说明。
请注意：出版商对作者提供的任何支持信息的内容或功能不承担责任。任何疑问（除内容缺失外）应直接联系文章通讯作者。
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