CRISPR技术帮助发现治疗渐冻人症的新靶点

肌萎缩侧索硬化病 （amytrophic lateral sclerosis，ALS） 俗称渐冻人症，是一种渐进并致命的神经退行性疾病。患者由于运动神经元的逐步死亡，导致肌肉功能退化，像刷牙、说话甚至呼吸这样简单的肌肉运动都最终无法进行。在患者大脑中出现的异常蛋白沉积是ALS的重要标志之一，但是科学家们并不清楚这些蛋白沉积如何导致神经元的死亡。日前，斯坦福大学 （Stanford University） 的研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对影响ALS症状的基因进行了筛选，研究结果不但帮助科学家们进一步了解了ALS的发病机制，而且为治疗ALS提供了新靶点。

在ALS患者中，很常见的一个病因是在C90RF72基因上出现的六核苷酸重复序列扩增（hexanucleotide repeat expansion），发生变异的基因会表达非常容易聚合的二肽重复（dipeptide repeat，DPR） 蛋白。这种DPR在细胞中的沉积被认为是导致神经细胞死亡的原因。

这项结果发表在《Nature Genetics》的研究中，研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在名为K562的人类细胞系中进行了全基因组敲除筛选 （genome-wide knockout screens）。CRISPR技术通常被用于修改基因序列，但是在这项研究中，它被用于在细胞中让人类基因组中的特定基因失活。然后研究人员将DPR蛋白加入到培养细胞的培养基中，检测在细胞中敲除特定基因让它们对DPR引发的细胞毒性更为敏感还是产生抗性。

研究人员首先在人类细胞系中对人类基因组中的所有基因进行了筛选，他们发现有几百个基因能够对DPR的细胞毒性有正面或者负面的影响。为了在与ALS更为接近的细胞环境下检验这些基因的功能，研究人员在模拟ALS的小鼠神经元细胞培养模型中对在人类细胞中对DPR毒性影响最大的大约200个基因进行了进一步检测。经过两轮筛选，研究人员发现十多个基因对DPR的细胞毒性有最大影响。

在这十几个基因中，有几个基因被敲除之后会对细胞产生很强的保护作用。例如，名为RBA7A的基因是一个内溶酶体运输基因 （endolysosomal trafficking gene），它可能在媒介DPR侵入细胞和在细胞之间的转播中起到重要作用。

而另一个受到研究人员关注的基因是Tmx2，当它在细胞中被敲除时，几乎100%的细胞在DPR存在的环境下能够存活，而通常只有10%的细胞能够存活。

“你可以想象Tmx2 蛋白可能会成为一个好的药物靶点，” 文章的第一作者，斯坦福大学的研究生Michael Haney先生说：“如果你有一个小分子化合物能够通过什么方法抑制Tmx2的功能，那么它有可能成为治疗ALS的疗法。”

Tmx2蛋白是在细胞内质网中的一种蛋白，它的功能还没有得到完全澄清。已有研究认为它可能在媒介内质网对环境中应激因子的反应中起着重要作用，特别是它可能触发细胞死亡。在这项研究中斯坦福的学者们认为Tmx2能够调节其它启动细胞死亡程序的基因。

“我认为理解Tmx2蛋白在细胞中的正常功能是下一步需要解决的问题，这会帮助我们发现当有毒蛋白杀死细胞时哪些功能受到了影响，并且指出我们应该继续考察哪些信号通路，” 文章的共同第一作者、斯坦福大学的研究生Nicholas Kramer先生说。

而在这项研究中使用的CRISPR筛选技术可以被用来研究其它疾病的信号通路。目前这项研究的团队正在试图使用同样的技术来研究其它由于毒性蛋白沉积造成的神经退行性疾病，其中包括亨廷顿病（Huntington’s disease），帕金森病 （Parkinson’s disease） 和阿兹海默病 （Alzheimer’s disease）。“我认为这是CRISPR筛选的一项非常令人兴奋的应用，而且它才刚刚开始，” 文章的资深作者、斯坦福大学的遗传学教授Michael Bassik博士说。