“2012LSAC生命科技论坛：干细胞技术与应用”嘉宾演讲摘要

　　“2012LSAC生命科技论坛：干细胞技术与应用”将于2012年10月17日~18日在上海新国际博览中心与“慕尼黑上海生化分析展”同期召开。

　　干细胞经历最近十年的飞速发展，从胚胎干细胞，到成体干细胞，进一步到iPS，以及这些细胞在动物实验和临床中应用，从小规模的临床研究到部分干细胞产品的上市，无疑给未来的临床应用领域提供巨大想象空间。

　　本次主题论坛旨在传递干细胞领域最新前沿进展，介绍干细胞基本研究最新技术与临床应用。论坛将邀请国内外著名的干细胞领域专家、学者，在介绍干细胞研究领域的最新进展同时，还邀请在干细胞领域技术方面具有突破性进展的企业科学家参与演讲，全面介绍干细胞领域领先的、实用新技术，促进基础研究与临床应用的融合。

　　以下是本次论坛的部分嘉宾的演讲摘要，更多相关资讯可关注生物谷会议官方微博（@生物谷会议），或登录会议官网：2012LSAC生命科技论坛：干细胞技术与应用

　　孙毅

　　Modeling Rett Syndrome using human ES cell-derived neurons

　　

　　Human pluripotent stem cells, including embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs), and their differentiated progeny offer extraordinary potential for medical research as cell therapy agents and disease models. It remains, however, a challenge to reveal physiologically-relevant phenotypes and underlying molecular and cellular mechanisms of complex human disorders using hESC/iPSC-derived systems{Marchetto, #136; Saha, 2009 #137}. Neuropsychiatric disorders often involve altered neuronal network activities {Ramocki, 2008 #116; Sudhof, 2008 #123}, providing a fundamental rationale for the examination of synaptic transmission in combination with mechanistic studies in hESC/iPSC-based disease models. As a proof-of-principle study, we report here the establishment of a hESC-based model for Rett Syndrome (RTT), an autism spectrum disorder (ASD) caused by mutations of the Methyl-CpG binding Protein 2 (MeCP2) gene{Amir, 1999 #16}. We demonstrate that MeCP2-deficiency in human neurons induces a shift of spontaneous synaptic activity from primarily glutamatergic excitatory (E) to predominantly GABAergic inhibitory (I) transmission. This increased inhibitory activity is associated with an increased density of GABAergic synapses, and with abnormal expression of several genes involved in synaptic transmission and autism. Using a genetic rescue approach we confirmed the causality between MeCP2 deficiency and the neurotransmission phenotype. Such genetic rescue paradigms could serve as essential controls in other human stem cell including iPSC-based disease models. In summary, we have established a novel hESC-based model for RTT and revealed robust and measurable disease-related phenotypes. The E/I neurotransmission imbalance and shared defects in gene expression suggest that RTT and autism might have common molecular mechanisms. Moreover, we demonstrated that the overall strategy of coupling synaptic transmission and gene expression analyses to phenotype hESC/iPSC-derived diseased neurons could become a general approach to tackle other neuropsychiatric or neurodevelopmental diseases, paving the way to novel therapeutic interventions.

　　康九红

　　组蛋白修饰在诱导多能干细胞形成中的作用与机制

　　

　　诱导多能干细胞（iPS）的诞生为病人的个性化治疗提供了新思路，但是在iPS细胞的形成机制依然需要进一步的探究。目前认为，组蛋白修饰（酶）等表观遗传修饰特异性的改变尤其是组蛋白乙酰化在iPS形成中具有极其重要的作用。我们的最新研究发现特定HDAC蛋白的干扰病毒可以有效促进iPS细胞进入成熟期进而提高诱导效率和质量，这些HDAC蛋白极有可能是通过多能性标志基因Nanog及其组成的正反馈环路进而在iPS细胞形成过程中发挥重要作用，这为组蛋白修饰在iPS细胞形成中的功能和机制提供了新的理论基础。

　　谢欣

　　化学小分子增强多能干细胞的诱导

　　

　　哺乳动物从受精卵发育成个体的过程一直被认为是不可逆的。而近期研究展示了已经分化的体细胞可以通过外源表达转录因子（包括Oct4, Sox2, Klf2, cMyc等）而被重编程回到类似胚胎干细胞的多能状态，而这类细胞被称为诱导多能干细胞（iPS）。iPS与胚胎干细胞非常相似，可分化为各种体细胞。四倍体互补实验也证实iPS可以独立发育成个体。由于不存在伦理问题及免疫排斥问题，iPS技术为干细胞的研究和临床应用提供了有利条件。然而，外源转录因子及病毒载体的使用使其安全性受到质疑；而且iPS的诱导效率尚底，诱导机制也不十分明了。这一切都阻碍了iPS的应用。

　　利用小分子化合物来增加iPS诱导效率，并辅助解析iPS诱导机制是一条可行之路。我们建立了基于96－孔板体系的筛选体系，寻找能够增加iPS效率并替代转录因子的小分子化合物，发现了一批能够有效促进重编程的化合物，包括老药LiCl等。

　　项春生

　　宫内膜干细胞诱导分化及其应用潜能

　　

　　干细胞在特定的体内外微环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞，甚至是一些曾经被人们认为不可再生的组织器官，通过移植参与受者组织的再生与修复，为临床医学提供了一个新的充满希望的治疗手段，使得一直困扰人类的医学难题有了新的希望，如肝病、糖尿病、癌症、帕金森病等。我国肝病大国，肝硬化是临床常见的危重症，且目前缺乏有效的治疗手段，病死率高。干细胞移植与传统肝移植治疗方法相比，不存在免疫排斥及伦理问题。这项技术风险小、痛苦少，利用其组织再生和损伤修复的功能，可在一定程度上改善终末期肝病患者的肝功能。

　　宫内膜干细胞是新近发现的间充质干细胞，符合间充质干细胞的一般标准，在体外可以稳定增殖而不发生核型的改变，具有免疫原性低，无致瘤性的特点，在体外可以诱导分化为多系细胞。该报告将从宫内膜干细胞体外诱导为肝样细胞、动物实验和临床研究等领域，揭示宫内膜干细胞在肝病损伤治疗中的应用潜能。

　　李凯

　　反因子核酸酶及其在干细胞基因工程与基因治疗中的应用

　　

　　转录激活样因子（TALE）为近年发现的一类可识别碱基的氨基酸序列高度重复蛋白质，来源于一种革兰氏阴性细菌，每一重复单元大多由33-35 个氨基酸组成，其中第12 和13 位氨基酸共同负责识别1 个碱基，目前广泛使用的识别单元为四种，即NI 识别A, HD 识别C, NG 识别T, NN 识别G 或 A。这种与核酸碱基具有确切互补识别关系的生物模块，可用于构建人工转录因子或基因工程酶，在工农业和生物医学中具有十分重大的理论和应用价值。其中由转录激活样因子与FokI 酶的核酸酶裂解中心所形成的反因子核酸酶（TAL effector nucleases,TALENs），在物种基因改造，基因治疗等多方面已显示出其他工程酶如锌指蛋白酶与归巢核酸酶或巨核酸酶所无法比拟的优势。近两年来，我们在TALE 这一具有巨大应用价值的生物元件的适配性与模块库的构建上，研发了高效的克隆技术，完成了包含256 个可识别任意4个碱基序列的TAL 模块文库，目前正在克隆一系列针对重要基因靶的TALENs。就我国科技发展而言，下列几个方向将使未来反因子核酸酶研究的重点：(1)识别八碱基TALE 文库的构建；(2)针对多个重要靶基因的TALENs的装配以及剪切谱与脱靶效应测评； (3) TALENs 用于遗传病的基因治疗可行性研究; (4) TALENs 用于肿瘤的基因治疗可行性研究; (5) TALENs 用于疾病动物模型构建的应用性研究; (6) TALENs 用于农作物物种改良的可行性研究。本报告将就TALENs的克隆，组装，作用于副作用评价，在干细胞基因工程中的应用，在正向基因治疗和反向基因治疗中的应用等，予以较详细介绍。

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　　时玉舫

　　间充质干细胞的免疫调节作用

　　

　　间充质干细胞（MSCs）也被称为多能间充质基质细胞，已被证实在体内多种组织中存在，并且在组织修复与再生过程中是一种十分重要的细胞来源。在组织损伤等病理条件下，这些细胞会迁移到损伤部位。在损伤部位，通常会伴随由先天免疫和获得性免疫细胞产生的促炎症细胞因子。间充质干细胞会在这些炎症因子刺激下被激活。事实上最近已有文章报道间充质干细胞与炎症细胞会相互作用，并且这种作用在决定炎症反应结果的过程中发挥重要作用。

　　我们发现了间充质干细胞对于免疫反应有直接的影响，即在动物和人中，无论是在体内还是体外都有很强的免疫抑制作用。我们利用小鼠骨髓来源的间充质干细胞克隆与新分离的T细胞共培养时，发现间充质干细胞能够抑制T细胞增殖以及其分泌的细胞因子。我们进一步证实了这种免疫抑制作用是IFN?与TNF?、IL-1? 或者 IL-1?三个细胞因子中的任何一种协同作用的结果。这些细胞因子的组合能够刺激间充质干细胞分泌大量的趋化因子以及一氧化氮合成酶（iNOS）。趋化因子能够把T细胞趋化到间充质干细胞周围，而周围高浓度的一氧化氮就能够抑制T细胞反应。这种由细胞因子刺激引起的免疫抑制现象在iNOS或者IFN?受体缺失小鼠的间充质干细胞中是不存在的。而且对趋化因子受体进行阻断也能去除野生型间充质干细胞的免疫抑制作用。在体内，野生型间充质干细胞能够治疗小鼠的GVHD，如果同时使用IFN?的抗体或者iNOS的抑制剂，这种治疗作用就会消失，同样的，iNOS或者IFN?受体缺失的间充质干细胞也没有治疗效果。野生型间充质干细胞也能够抑制迟发型过敏反应，而iNOS缺失的间充质干细胞却相反的有加重效果。有趣的是，我们最近研究表明人来源的间充质干细胞也同样在受到类似的细胞因子刺激时有免疫抑制作用，与小鼠不同的是，起到免疫抑制作用的因子不是一氧化氮，而是IDO。因此，促炎症因子能够诱导间充质干细胞产生趋化因子和一氧化氮（小鼠）或者IDO（人），它们能够协同作用行使免疫抑制作用。在临床上，人类来源的间充质干细胞已经在晚期肝病病人中展示了惊人的治疗效果。

　　同时我们发现间充质干细胞在某些情况下也能促进免疫反应。这种免疫促进作用发生在微环境中炎症因子的量不足以刺激间充质干细胞产生足够大量的NO时。当iNOS的活性被抑制或使用iNOS缺失的MSCs时，MSCs会在体外T细胞增殖实验中强烈地促进T细胞的扩增。我们也在小鼠迟发性超敏反应（DTH）这一体内模型中得到了类似的结果。此外，iNOS缺失的MSCs能显著地抑制黑色素瘤的生长。这可能是在缺乏NO的情况下，MSCs产生的趋化因子能促进免疫反应。事实上，在趋化因子CCR5和CXCR3双敲除小鼠体内，iNOS缺失的MSCs抑制黑色素瘤生长的能力被大大削弱了。因此，NO在MSC介导的免疫调节作用中发挥了类似调节开关的作用。更重要的是，我们在人体来源的MSCs中发现了其对免疫系统有类似的双效免疫调节作用。在这一调节过程中，吲哚胺双加氧酶（IDO）发挥了调节开关的作用。这一研究为我们理解MSCs在病理及生理过程中的作用提供了新的信息。

　　间充质干细胞在体外培养时具有强大的增殖能力，足够为体外和体内研究使用。对于其免疫调节的性质的进一步研究会为其临床应用提供至关重要的信息。

　　张志英

　　人骨髓基质干细胞源性神经元的形成及对损伤脊髓的保护作用

　　

　　脑或脊髓的创伤或退行性疾患如脊髓损伤（spinal cord injury）、中风（stroke）、Parkinson's 病, 老年痴呆（Alzheimer's disease）, 肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS) ，多发性硬化（multiple sclerosis，MS)等是由于中枢神经系统内神经元或神经胶质细胞的丢失而导致的。细胞替代疗法为神经系统的疾患提供了最有效的治疗前景。但获得有效的、安全的、不同功能的神经元仍制约着目前临床的治疗应用。最近的研究显示一些小分子物质可以增加细胞的多潜能特性、调控细胞的分化潜力。我们采用DNA甲基转移酶、组蛋白乙酰化转移酶等抑制剂影响细胞的表观遗传特性、提高细胞的多潜能性，同时通过提高细胞内cAMP等神经元诱导法成功地将骨髓基质干细胞诱导形成多巴胺能及胆碱能神经元，免疫荧光、Western blot及ELISA等多种方法证实了这一结果。细胞移植入大鼠损伤脊髓后，大鼠的运动及感觉功能均有不同程度的改善，细胞能够存活、但存活率还有待改善，如何能够增加植入体内细胞的存活率，是我们今后进一步关注的重点。

　　卫立辛

　　干细胞在炎症相关的肝病中作用及应用前景

　　

　　干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下可分化为多种功能的细胞。不但在疾病治疗和再生医学领域显示了广阔的应用前景，同时干细胞及其微环境异常也与许多疾病的发生密切相关。相关研究不但有助于干细胞应用，同时有助于相关疾病发病机制认识。炎症相关肝病是影响国人健康的一类主要疾病，包括肝炎、肝硬化及肝癌。这类疾病均伴有炎症损伤和修复，干细胞与这类疾病发生发展密切相关，但其确切作用及机制不清。间充质干细胞（MSCs）具有向组织损伤部位特异性趋化的特性，因此MSCs可特异性趋化至肝脏损伤部位参与修复。一方面MSCs具有多向分化潜能，可通过直接分化为成体细胞达到修复损伤的作用；另一方面，MSCs的免疫抑制功能在减轻肝脏炎症相关的肝损伤方面起到重要作用。MSCs表达I类主要组织相容性复合体而不表达II类主要组织相容性复合体及B7-1, B7-2等，这使得MSCs免疫原性较弱。输注同种异体MSCs甚至异种MSCs，一般不易引起宿主的免疫排斥反应。在MSCs对T细胞的免疫抑制过程中，细胞间接触及可溶性因子的作用均十分重要。目前多种免疫抑制相关因子包括TGF-β、IL-10、Prostaglandin E2(PGE2)、Hepatocyte growth factor (HGF)、Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)及 Inducible nitric oxide synthase (iNOS）均与MSCs的免疫抑制功能有关。趋化至肝损伤部位的MSCs可通过其免疫抑制功能有效降低肝脏炎症相关的损伤，保护肝功能。因此，MSCs在炎症相关的肝病治疗中对于肝功能的保护和恢复可能起到重要作用，具有非常广阔的临床应用前景。

　　钱程

　　靶向肿瘤干细胞治疗癌症的新策略

　　

　　肿瘤干细胞是一群具有自我更新、多向分化潜能、具有启动和重建肿瘤组织表型能力的肿瘤细胞。前期研究均表明，肿瘤干细胞形成于肿瘤早期甚至癌前病变，始动肿瘤发生和演进；肿瘤干细胞具有多向分化潜能，是肿瘤成分多样性和分化异质性的原因；肿瘤干细胞具有高侵袭性，是转移的源泉；肿瘤干细胞抵抗化疗和放疗，是肿瘤复发的根源；肿瘤干细胞始动和促进血管生成，为肿瘤提供营养；肿瘤干细胞具有抑制免疫细胞活性并参与肿瘤免疫逃逸机制的形成。因此，靶向肿瘤干细胞的治疗策略将有望为癌症的治疗带来希望。

　　我们课题组成功的从肝癌组织中，分离出多能转录因子Nanog高表达的新型肝癌干细胞。证实Nanog阳性的肿瘤细胞具有更强的自我更新、克隆形成和肿瘤起始能力。他们参与肿瘤的复发和对化疗药物的耐受。进一步研究发现，Nanog不仅可作为肿瘤干细胞的分子标志物，同时它可通过IGF信号通路参与肿瘤干细胞的自我更新。并建立以肿瘤干细胞为平台和Nanog为靶点的高内涵药物筛选平台，已筛选出多个靶向肿瘤干细胞的小分子化合物和特异性单克隆抗体。通过该项研究，我们发现HDAC抑制剂可诱导肿瘤干细胞的分化，导致肿瘤干细胞对化疗的敏感性，联合分子靶向药物Sorafenib成功的治疗肝癌。

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　　孙凌云

　　异基因间充质干细胞移植治疗自身免疫病

　　

　　间充质干细胞( MSCs)是来源于发育早期中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，广泛存在于全身多种组织器官，可在体外培养扩增，并能分化为神经细胞、心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，在细胞替代治疗及组织工程方面具有极大的应用价值。

　　我们用异基因正常鼠、人骨髓或脐带来源MSCs移植狼疮鼠（MRL/lpr），发现移植后尿蛋白显著下降，疾病活动相关指标得到改善，且肾脏病理学变化明显减轻, 移植过程中及移植后均无排斥反应发生。同时发现经外周静脉输注的异基因MSCs可迁移到病变小鼠脾脏、肾脏、肝脏、皮肤等组织，上调脾脏及淋巴结组织Foxp3+Treg比例及抑制炎症趋化因子HMGB1、MCP-1表达。新近研究发现输注体外扩增的自体或异体骨髓来源MSCs可明显降低胶原诱导关节炎（CIA）小鼠关节评分，抑制骨质破坏。这种治疗作用的发挥除MSCs显著抑制Th1细胞分化外，还表现为MSCs可上调Treg比例、促进Th2细胞分化；同时有研究表明MSCs的成骨、成软骨分化功能也在其促进骨质修复方面发挥重要作用。MSCs可通过抑制Th1及Th17细胞分化及相关因子的表达，上调Treg及促进Th2细胞分化，发挥抗炎及免疫调节作用，减小MS模型鼠大脑病变范围，降低MS疾病评分，且不同种属及组织来源MSCs均可发挥治疗作用。

　　我们自2007年3月在世界上首次开展异基因MSCs移植治疗重症难治性SLE患者，取得显著临床疗效。异基因骨髓或脐带来源MSCs移植可降低SLE患者疾病活动性评分，改善蛋白尿、肾功能及血清学指标，延缓系统受累，诱导疾病缓解，减少激素及免疫抑制剂用量，减轻药物相关并发症。对其机制方面的研究发现，正常MSCs可上调SLE患者外周血Treg细胞数量，抑制Th2体液免疫反应，抑制抗体产生，纠正患者体内细胞及体液免疫失衡。

　　此外，我们开展了异基因MSCs移植治疗其他自身免疫病的临床研究，发现MSCs移植可显著降低难治性RA患者DAS评分，改善生活质量，上调外周血Treg水平。对于难治性多发性肌炎/皮肌炎患者，异基因MSCs移植可较好控制血清肌酸激酶水平，减少激素及免疫抑制剂用量，延缓疾病进展。同时，MSCs对SSc、原发性干燥综合征，炎症性肠病 、1型糖尿病 、白塞病 、多发性硬化等自身免疫病均有较好的治疗作用，可诱导疾病缓解，减轻影像学及病理学改变，改善患者生活质量评分，改善免疫病相关系统并发症如间质性肺炎、难治性皮肤溃疡、难治性血细胞减少等。部分患者移植后病情有所复发，给予多次异基因MSCs输注仍有临床疗效,至今已完成360例患者的治疗。

　　孙鲁申

　　临床级干细胞技术标准与管理规范

　　

　　当今是一个细胞治疗技术的快速发展与市场乱象并存的现状，外媒对中国细胞治疗市场的质疑声声。其主要原因在于缺乏统一的标准和规范，导致临床滥用，乱象丛生 ，缺乏系统的科学的客观评价和专家认同；其管理办法、监管机制、审批机构、申报程序、审批标准等政策法规相对滞后，管理监管缺失缺位，致使各级卫生行政部门承担着巨大的政策和管理风险，也严重影响了细胞治疗的科学发展和可持续发展，也给患者带来了潜在的医疗和伦理风险。因此，亟待建立创新性管理思路，建立标准化规范化的有效、安全、可控的临床细胞治疗技术平台，配备合适的硬件设施、管理人员、管理体系和对其有效性、安全性、可控性的量化评估。确保获取高纯度、高质量、无污染的临床级细胞。

　　殷勤伟

　　成体间充质干细胞转决定的分子机制

　　

　　目的：近来的研究表明小RNA具有调控干细胞自我更新和定向分化的功能，间充质干细胞能分化为三胚层的一些细胞。但至今尚不清楚成体间充质干细胞转决定为其他干细胞（如造血干细胞）的分子机理，不能获得大量的转决定后均一的干细胞群，也不清楚小RNA怎样调控此过程的发生。由于对这些问题的深入和全面地研究，有助于了解成体干细胞横向分化的分子机制，有助于获得临床级的干细胞用于疾病的治疗，也有助于解决干细胞应用中的许多实际问题。

　　方法和结果：在国家"863"专题的支持下，我们使用易于获得的人体脂肪间充质干细胞为研究对象（不需要配型、不需要干细胞库，无免疫排斥，可大量扩增），通过生物信息学和小RNA芯片筛选和鉴定一组新的人内源性小RNA，在我们自主研制的多肽纳米运载系统的帮助下，高效地将它们导入（转染率大于98%）间充质干细胞，从而获得了高转化率（大于80%）的造血干细胞以及相应的三系血细胞。通过体外的造血干细胞和主细胞的集落形成试验和体内的造血系统重建试验验证了这些诱导的造血干细胞具有长期的自我更新能力和向各种血细胞的分化能力。

　　结论：为解决我国的血荒问题提供了新的技术和途径，为人工造血提供了新的思路和方法，使血液病包括白血病的个体化治疗成为可能。这一革命性医疗技术的深入和推广，将形成巨大的社会效益和每年数亿至数百亿元人民币产值的可观的经济效益。

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