摘要
血红蛋白分解产生的铁释放是脑出血（ICH）后细胞毒性的关键介质。我们此前已证明，携带H67D突变的铁稳态调节基因（HFE）小鼠在ICH后表现出显著的神经保护作用。这种改善可能源于内源性Nrf2抗氧化系统的上调。先前对H67D小鼠的研究发现，GSK3β（一种促进Nrf2降解的激酶）活性降低。有趣的是，药理学抑制GSK3β已被证明能大幅改善ICH动物模型的结果。然而，尚不清楚该通路是否负责H67D动物中增强的抗氧化反应。在本研究中，H67D和WT小鼠在ICH前14天每天腹腔注射SB216763（一种GSK3β选择性抑制剂）。通过转棒实验评估功能运动恢复，并使用Fluorojade-B测量神经退行性变。通过免疫印迹法评估抗氧化反应和GSK3β活性，检测Nrf2、GPX4、FTH1和β-Catenin。在ICH后3天，与WT-载体对照组相比，经SB216763处理的WT小鼠表现出增强的功能恢复、减少的退行性神经元以及大脑中Nrf2和GPX4水平升高。此外，与H67D-载体对照组相比，SB216763处理对H67D小鼠的测量结果未产生显著变化。总之，WT小鼠在ICH后受益于GSK3β抑制，而H67D动物则没有。这表明H67D动物中抗氧化反应的调节可能已达到生物学极限。重要的是，这些数据表明，旨在改善ICH结果的临床试验，尤其是通过GSK3β抑制，必须考虑HFE基因型，因为这种在世界范围内约20%人群中存在的突变可能会改变ICH恢复，无论是否接受治疗。
缩写
ARE：抗氧化反应元件
FJB：Fluorojade-B
FTH1：H-铁蛋白
GPX4：谷胱甘肽过氧化物酶4
GSK3β：糖原合酶激酶-3β
HFE：稳态铁调节因子
ICH：脑出血
ICP-MS：电感耦合等离子体质谱
Nrf2：核因子红细胞2相关因子
ROS：活性氧
RRID：研究资源标识符
1 引言
红细胞溶解和血红素分解释放的亚铁离子在脑出血（ICH）后的氧化损伤中起关键作用。其氧化还原活性通过芬顿反应自发催化活性氧（ROS）的形成，导致氧化应激积累、DNA损伤、线粒体功能障碍，最终引起铁死亡。核因子红细胞2相关因子（Nrf2）是抗氧化反应的主要转录因子，对于逆转和限制ICH后的氧化应激至关重要。在基线状态下，Nrf2在细胞质中被Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）结合，并在生理条件下被快速降解。Keap1含有多个反应性半胱氨酸基团，这些基团在氧化应激下被修饰，从而使Nrf2稳定并转运至细胞核（Baird and Dinkova-Kostova 2011; Suzuki and Yamamoto 2015）。在核内，Nrf2结合称为抗氧化反应元件（ARE）的调控序列，表达抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和FTH1，这些酶直接还原脂质过氧化物为脂肪醇，并抵抗氧化应激的有害影响（Dodson et al. 2019; Baird and Dinkova-Kostova 2011; Raghunath et al. 2018）。研究一致表明，血肿周围区域的Nrf2水平升高，从而证明其在介导ICH后氧化应激中的关键作用（Chen-Roetling and Regan 2016; Wang et al. 2007）。
此前，我们证明了铁稳态调节（HFE）基因中的一个常见突变能增强小鼠ICH后的恢复（Helmuth, Kumari, Palsa, Neely, et al. 2023）。我们发现，在ICH后，携带H67D HFE突变的小鼠表现出更好的功能运动恢复、血肿周围区域神经元退行性变减少以及铁死亡标志物降低。在血肿周围组织中，我们还发现与野生型动物相比，通过Nrf2、GPX4和FTH1的上调，抗氧化反应增强。通常，HFE通过竞争性结合细胞膜上的转铁蛋白受体（TfR）来负向调节转铁蛋白结合的铁摄取。然而，H67D突变导致HFE与TfR的亲和力降低，导致人和小鼠出现亚临床性脑铁积累。假设具有这种突变的动物表现出对铁相关应激的适应性或激素反应，因为增加的铁作为低剂量应激源，随时间推移建立对氧化应激的耐受性（Marshall Moscon et al. 2024）。值得注意的是，人类中相应的突变H63D HFE在世界范围内的患病率约为20%，这可能影响临床人群的ICH恢复（Hanson et al. 2001）。
我们实验室利用H67D动物脑组织的RNAseq和免疫印迹数据发现，Nrf2的正向调节因子——过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（PGC-1α）上调（Song 2020）。PGC-1α通过磷酸化使糖原合酶激酶-3β（GSK3β）失活，从而稳定Nrf2。正常情况下，GSK3β通过直接磷酸化Nrf2促进其降解，从而负向调节Nrf2的激活（Aschner and Culbreth 2018; Rada et al. 2011）。因此，使GSK3β失活可通过阻止Nrf2的降解并维持其在从Keap1释放后的核内水平，从而正向调节Nrf2的激活。从机制上讲，该通路可以解释H67D小鼠在ICH后抗氧化反应的差异，从而导致更好的ICH结果。
在ICH动物模型中，对Nrf2通路的药理学操作已被充分证实（Zhao, Sun, Ting, et al. 2015; Zhao et al. 2007; Yin et al. 2015; Iniaghe et al. 2015; Zhao, Sun, Zhang, et al. 2015; Sukumari-Ramesh and Alleyne 2016; Imai et al. 2021）。然而，所有这些化合物都靶向Keap1的半胱氨酸残基以促进Nrf2解离，尽管在动物研究中显示出显著效果，但尚未在临床人群中进行尝试或证明有效。鉴于缺乏积极的临床结果以及持续的证据表明Nrf2通路对促进ICH恢复至关重要，最近的研究集中于通过抑制GSK3β来新型激活Nrf2（Zhao et al. 2017; Shi et al. 2024）。
H67D HFE突变产生的神经保护环境具有巨大潜力，可揭示减轻ICH损伤的关键生物学通路。我们之前的数据表明，该突变导致ICH后更好的结果和基线时更低的GSK3β活性。然而，尚不清楚GSK3β是否为该通路中负责上调抗氧化系统以改善H67D动物ICH结果的关键点，或者对此通路的操作是否能在这些动物中产生额外的神经保护。因此，本研究的目的是通过药理学操作确定GSK3β对观察到的基因型依赖性神经保护的贡献。总体而言，这项研究将揭示GSK3β/Nrf2通路在一种常见的HFE变异体中对ICH恢复的重要理解，这可能会影响未来的治疗策略。
2 方法
动物研究遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》。该方案获得了宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会的批准（方案编号：20190115）。实验人员在行为评估和免疫组化分析期间对每只动物的基因型和治疗条件不知情。之后揭盲以完成统计分析。此外，数据按照ARRIVE指南获取。
2.1 药物给药
为了确定GSK3β抑制对ICH结果的影响，每只动物在ICH前14天每天注射载体或GSK3β选择性抑制剂（SB 216763, Tocris, Cat# 1616）（10 mg/kg，腹腔注射），并在ICH后每天注射直至安乐死。该剂量在之前的文献中被发现能成功抑制小鼠大脑中的GSK3β（D'Angelo et al. 2016）。每天新鲜配制SB 216763，浓度为2 mg/mL，含5% DMSO的玉米油溶液。载体处理使用同等体积的含5% DMSO的玉米油。
2.2 动物ICH模型
本研究使用了6月龄的雌性和雄性C57BL/6J × 129小鼠，携带H67D HFE（n=29，雄性=18，雌性=11）或野生型HFE（n=29，雄性=15，雌性=14）基因。样本量根据我们最初的研究计算，以0.8的统计效力在α水平0.05下检测0.2的差异（Helmuth, Kumari, Palsa, et al. 2023）。H67D敲入由ingenious Targeting Laboratory（Ronkonkoma, NY）创建（Tomatsu et al. 2003）。这些小鼠饲养在宾夕法尼亚州立大学医学院动物护理设施的灭菌塑料笼中，12小时光照/黑暗循环，可自由获取标准饲料和水。每笼最多饲养3只。一只WT-载体对照和两只H67D-SB216763治疗动物在ICH后死亡。没有其他动物被排除在研究之外。此外，动物根据可用性随意选择并分配到实验组。采用两步自体血液输注模型创建脑出血，按照先前发表的方法进行。在此，小鼠在1%–2%吸入异氟烷下麻醉，并固定在立体定位仪上。在手术过程中频繁通过缺失脚趾夹反射评估麻醉深度。去除动物头骨上方的毛发，用乙醇棉签和聚维酮碘擦洗准备手术区域。然后做中线切口暴露前囟和后囟。在前囟前方0.5 mm、侧方2.0 mm处钻一个1 mm的骨孔。接下来，从动物脸颊静脉抽取30 μL血液，以1 μL/min的速度直接通过骨孔注入右侧尾状核（深度3.5 mm），使用Hamilton注射器。注射器停留20分钟后缓慢拔出，以尽量减少血液反流。然后用骨蜡封闭骨孔，用三根间断的3-0 vicryl缝线闭合头皮切口。然后将动物从立体定位仪上取下，放入37°C培养箱中恢复。在手术前给每只动物皮下注射缓释丁丙诺啡（3.25 mg/kg）以减少实验期间的疼痛。手术后每只动物被监测数小时，并由研究人员和宾夕法尼亚州立大学医学院的训练有素的兽医每天仔细评估。没有动物表现出过度疼痛的迹象，如弓背、严重嗜睡、呼吸窘迫或术后严重脱水。ICH后三天，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）麻醉小鼠。一旦通过缺失脚趾夹反射确认完全麻醉，小鼠通过经心灌注乳酸林格液安乐死。然后取出每只动物的大脑并保存用于后续分析。
2.3 功能运动评估
使用先前公布的转棒渐进式方案评估运动功能（Ruan and Yao 2020）。简言之，每只动物在ICH诱导前训练3天。训练期间，每只动物在棒上适应30秒而不旋转。然后棒以4 rpm旋转。一旦动物在此速度下完成60秒，即认为训练完成。测试期间，棒转速在2.3 功能运动评估
使用先前公布的转棒渐进式方案评估运动功能（Ruan and Yao 2020）。简言之，每只动物在ICH诱导前训练3天。训练期间，每只动物在棒上适应30秒而不旋转。然后棒以4 rpm旋转。一旦动物在此速度下完成60秒，即认为训练完成。测试期间，棒转速从4 rpm在120秒内增加至20 rpm，然后在20 rpm保持额外60秒。每只动物在ICH诱导后每天进行测试，直到被处死。
2.4 Fluoro-Jade B和H&E染色
一部分动物在ICH后3天被处死，以利用Fluoro-Jade B染色（FJB）检测退行性神经元的差异。将如上所述用多聚甲醛固定的大脑在最佳切割温度化合物中冷冻，并切成15 μm冠状切片。取每只动物距离针道100 μm内的3个切片，用PBS清洗，并根据制造商说明用FJB染色（VWR, Cat# 76459-462）。使用Nikon荧光显微镜（Nikon H600L Intensilight C-HGFIE）拍摄每个切片的图像。使用ImageJ软件（RRID: SCR_003070）盲法量化纹状体内血肿周围FJB阳性细胞总数。
此外，我们之前已验证了每种基因型出血大小一致性的程序（Helmuth, Kumari, Palsa, Neely, et al. 2023）。为确保这一点，取血肿的二十微米系列冠状切片，并根据制造商说明用苏木精和伊红染色（Abcam, Cat: ab245880）。然后由一名盲法研究人员使用ImageJ软件计算每个切片的横截面积。
2.5 免疫印迹法
如前所述通过免疫印迹检测蛋白质水平（Palsa et al. 2023）。动物在ICH后3天处死，并用乳酸林格液灌注。快速取出大脑，在矢状面平均分成两个半球，并立即在异戊烷中速冻。每个半球在NP40缓冲液（Thermo, Cat# FNN0021）和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma, Cat# P8340）中单独匀浆，并使用二喹啉甲酸检测法（Thermo, Cat# 23225）量化总蛋白。然后，将25 μg细胞蛋白加载到4%至20%的Criterion TGX预制蛋白凝胶（Bio-Rad）上。将蛋白质转移至PVDF膜。用含1% Tween20的Tris缓冲盐水中的5%牛奶封闭膜，然后探测FTH1（Cell Signaling Technology, 1:1000, 4393S; RRID: AB_11217441）、Nrf2（Abcam, 1:1000, ab92946, RRID: AB_10561604）、GPX4（Abcam, 1:1000, ab125066, RRID: AB_10973901）、β-Catenin（Abcam, 1:1000, ab223075, RRID: AB_3083545）或β-肌动蛋白（Abcam, 1:1000, ab115777, RRID: AB_10899528），后者作为上样对照。然后将PVDF膜与适当的HRP偶联二抗（1:5000, GE Amersham）孵育，并使用ECL试剂（PerkinElmer）在ChemiDoc MP成像系统（Biorad, RRID: SCR_019037）上可视化条带。目标蛋白归一化至β-肌动蛋白，并以比率表示。
2.6 统计学
使用GraphPad Prism 9进行统计分析。使用独立样本t检验比较组间治疗差异（WT-载体对照组 vs. WT-SB216763治疗组以及H67D-载体对照组 vs. H67D-SB216763治疗组）。使用单因素方差分析和Tukey事后检验比较组间的功能运动恢复和神经元退行性变。数据集通过了Shapiro-Wilk正态性检验。未进行异常值检验。所有数据均以均值和标准差表示，显著性由p值<0.05确定。
3 结果
3.1 SB 216763抑制WT小鼠大脑中的GSK3β，但不抑制H67D小鼠
GSK3β在Wnt/β-Catenin信号通路中发挥重要作用。在没有Wnt信号的情况下，β-Catenin被GSK3β磷酸化，从而促进其不稳定和随后的降解。因此，药理学GSK3β抑制应增加β-Catenin水平。为了测量SB 216763对GSK3β抑制的效果，使用Western blot在同侧ICH影响半球和对侧非ICH影响半球中测量β-Catenin（图1）。独立样本t检验显示，与WT-载体对照组（均值=0.476, SD=0.065, n=7）相比，WT-SB216763治疗动物的β-Catenin水平（均值=0.946, SD=0.065, n=7）显著增加（p<0.0001）；然而，与H67D-载体对照组（均值=1.083, SD=0.094, n=8）相比，H67D-SB216763治疗动物的β-Catenin水平（均值=1.002, SD=0.076, n=7）无显著差异（p=0.201）。与同侧半球相似，独立t检验显示，与WT-载体对照组（均值=0.603, SD=0.061, n=7）相比，WT-SB216763治疗动物的β-Catenin水平（均值=0.915, SD=0.073, n=7）显著增加（p=0.0490）；然而，与H67D-载体对照组（均值=1.128, SD=0.326, n=8）相比，H67D-SB216763治疗动物的β-Catenin水平（均值=1.259, SD=0.230, n=7）无显著差异（p=0.638）。
图1 SB216763有效抑制WT小鼠大脑中的GSK3β，但不抑制H67D小鼠。SB216763对ICH影响半球中β-Catenin水平的影响（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=3）以及非ICH影响半球（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=3）（独立样本t检验）。数据表示为均值±标准差；*p<0.05；****p<0.0001。
3.2 SB216763不影响野生型或H67D动物的血肿大小
为了测量SB216763在ICH后3天对血肿体积的影响，对WT-载体对照（n=4，雄性=2，雌性=2）、WT-SB216763治疗（n=4，雄性=3，雌性=1）、H67D对照（n=4，雄性=2，雌性=2）和H67D-SB216763治疗（n=4，雄性=2，雌性=2）动物的系列冠状切片进行H&E染色。WT-载体对照（均值=0.088 μm³, STD=0.006 μm³）、WT-SB216763治疗（均值=0.077 μm³, STD=0.009 μm³）、H67D对照（均值=0.084 μm³, STD=0.011 μm³）和H67D-SB216763治疗（均值=0.083 μm³, STD=0.01 μm³）动物的病变体积无显著差异（图2）。
图2 SB216763不影响野生型或H67D动物的血肿大小。SB216763对ICH后3天血肿体积的影响显示无显著差异。（A）WT-载体对照（n=4，雄性=2，雌性=2，均值=0.088 μm³, STD=0.006 μm³）（B）WT-SB216763治疗小鼠（n=4，雄性=3，雌性=1，均值=0.077 μm³, STD=0.009 μm³）（C）H67D对照小鼠（n=4，雄性=2，雌性=2，均值=0.084 μm³, STD=0.011 μm³）和（D）H67D-SB216763治疗小鼠（n=4，雄性=2，雌性=2，均值=0.083 μm³, STD=0.01 μm³）。数据表示为均值±标准差。
3.3 WT小鼠在SB216763治疗后表现出改善的功能恢复，而H67D小鼠则没有
通过每天测量每只动物在ICH后从转棒上掉落的潜伏期来评估其功能运动能力（图3）。功能受损更严重的动物会更快地从棒上掉落。ICH后前两天，各组之间无统计学显著差异。然而，在第3天，WT-载体对照组（均值=54.93秒, SD=22.69秒, n=15）的表现显著差于WT-SB216763治疗组（均值=87.36秒, SD=27.80秒, n=14, p=0.011）、H67D-载体对照组（均值=112.60秒, SD=45.13秒, n=15, p=0.0013）和H67D-SB216763治疗组（均值=102.08秒, SD=40.71秒, n=13, p=0.0079）。在ICH后3天，H67D-载体对照组和H67D-SB216763治疗组之间（p=0.915）或H67D-载体对照组和WT-SB216763治疗组之间（p=0.286）的运动功能无统计学显著差异。
图3 WT小鼠在SB216763治疗后表现出改善的功能恢复，而H67D小鼠则没有。使用从转棒掉落的潜伏期（秒）来评估功能运动恢复并反映不同组别的神经恢复情况（单因素方差分析）。ICH后前2天未发现差异。WT-载体对照（n=15，雄性=8，雌性=7）在ICH后3天显示功能运动恢复在统计学上显著低于WT-SB216763治疗组（n=14，雄性=10，雌性=4）、H67D-载体对照（n=16，雄性=8，雌性=8）和H67D-SB216763治疗组（n=13，雄性=7，雌性=6）。数据表示为均值±标准差；*p<0.05；**p<0.01。
3.4 WT小鼠在SB216763治疗后表现出减少的血肿周围神经退行性变，而H67D小鼠则没有
Fluoro-Jade B（FJB）是一种染色退行性神经元的阴离子荧光素。使用这种染料，研究了各组之间血肿周围区域退行性神经元的数量（图4）。双因素方差分析显示治疗×基因型存在显著交互作用[F (1, 23)=8.86; p=0.006]。多重比较确定，WT-载体对照（均值=385.13, SD=125.38, n=8）的退行性神经元显著多于WT-SB216763治疗组（均值=181.50, SD=85.60, p=0.004, n=7）和H67D-载体对照组（均值=206.28, SD=125.38, p=0.017）。此外，H67D-载体对照组和H67D-SB216763治疗组（p=0.952）或WT-SB216763治疗组和H67D-载体对照组（p=0.971）之间的FJB染色无显著差异。
图4 WT小鼠在SB216763治疗后表现出减少的血肿周围神经退行性变，而H67D小鼠则没有。利用Fluoro-Jade B染色确定血肿周围区域退行性神经元数量的差异：（A）WT-载体对照小鼠（n=8，雄性=4，雌性=4）血肿周围区域的FJB阳性细胞显著多于（B）WT-SB216763治疗小鼠（n=7，雄性=5，雌性=2）、（C）H67D对照小鼠（n=8，雄性=3，雌性=3）和（D）H67D-SB216763治疗小鼠（n=6，雄性=3，雌性=3）。数据表示为均值±标准差；*p<0.05；**p<0.01。
3.5 WT小鼠在SB216763治疗后表现出增强的抗氧化反应，而H67D小鼠则没有
为了测量GSK3β抑制对抗氧化反应的影响，对主转录因子Nrf2进行了研究（图5）。独立样本t检验显示，与WT-载体对照组（均值=0.494, SD=0.100, n=7）相比，WT-SB216763治疗动物的Nrf2水平（均值=0.797, SD=0.232, n=7）显著增加（p=0.0005）。此外，与H67D-载体对照组（均值=1.012, SD=0.110, n=8）相比，H67D-SB216763治疗动物的Nrf2水平（均值=0.823, SD=0.081, n=7）无显著差异（p=0.0724）。在对侧非ICH影响半球内，未发现显著差异。
图5 WT小鼠在SB216763治疗后ICH影响半球中的Nrf2水平升高，而H67D小鼠则没有。SB216763对ICH影响半球中Nrf2水平的影响（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=3）以及非ICH影响半球（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=3）（独立样本t检验）。数据表示为均值±标准差；***p<0.001。
我们还测量了GPX4水平，这是Nrf2的一个转录靶标，可通过逆转脂质过氧化作用直接抵抗铁死亡的影响（图6）。在此，与WT-载体对照组（均值=0.615, SD=0.146, n=7）相比，WT-SB216763治疗动物的GPX4水平（均值=0.940, SD=0.141, n=7）显著增加（p=0.0003）。此外，与H67D-载体对照组（均值=1.171, SD=0.124, n=8）相比，H67D-SB216763治疗动物的GPX4水平（均值=1.062, SD=0.085, n=7）无显著差异（p=0.359）。在对侧非ICH影响半球内，未发现显著差异。
图6 WT小鼠在SB216763治疗后ICH影响半球中的GPX4水平升高，而H67D小鼠则没有。SB216763对ICH影响半球中GPX4水平的影响（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=3）以及非ICH影响半球（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=3）（独立样本t检验）。数据表示为均值±标准差；****p<0.0001。
最后，我们测量了FTH1，这是一种重要的铁螯合和转运蛋白，也受Nrf2转录激活调控（图7）。独立样本t检验显示，在受到卒中影响的半球中，与WT-载体对照组（均值=0.892, SD=0.132, n=7）相比，WT-SB216763治疗动物的FTH1水平（均值=0.971, SD=0.096, n=7）无显著增加（p=0.656）。此外，与H67D-载体对照组（均值=1.167, SD=0.181, n=8）相比，H67D-SB216763治疗动物的FTH1水平（均值=1.11, SD=0.064, n=7）无显著差异（p=0.827）。在对侧非卒中影响半球中也观察到类似效果，该半球的FTH1无统计学显著差异。
图7 WT和H67D小鼠在SB216763治疗后ICH影响半球中的FTH1均无显著增加。SB216763对ICH影响半球中FTH1水平的影响（WT-载体对照组n=7，雄性=4，雌性=3 对比 WT-SB216763治疗组n=7，雄性=5，雌性=2；H67D-载体对照组n=8，雄性=4，雌性=4 对比 H67D-SB216763治疗组n=7，雄性=4，雌性=34 讨论
本研究旨在通过药理学操作确定GSK3β对脑出血（ICH）后基因型依赖性神经保护的贡献。我们确定，选择性ATP竞争性抑制剂SB216763能成功且显著地降低WT小鼠大脑中的GSK3β活性，表现为β-Catenin水平升高。与WT-载体对照组小鼠相比，经SB216763处理的WT小鼠在卒中影响半球的Nrf2水平升高，这是GSK3β抑制的结果。因此，这导致GPX4水平相应增加，这可能有助于观察到经SB216763处理的WT小鼠与WT-载体对照组相比血肿周围区域神经退行性变减少和功能恢复改善。尽管如此，GSK3β抑制并未导致经SB216763处理的WT小鼠中FTH1显著增加，尽管已知FTH1基因含有ARE。此外，在WT动物中，研究所用剂量的GSK3β抑制程度未能重现H67D-载体对照组动物在ICH后基线状态下的内源性Nrf2、GPX4或FTH1水平。尽管如此，这些水平显著减少了经SB216763处理的WT小鼠血肿周围区域的神经退行性变，并改善了功能结局。总体而言，这些结果不仅强化了先前关于GSK3β抑制在WT动物ICH后具有治疗潜力的研究，而且还提出了新颖且可能具有临床意义的发现，即H67D（或人类H63D）对该治疗方法无反应。
自然情况下，GSK3β通过直接磷酸化和泛素介导的Nrf2破坏来负向调节抗氧化系统。GSK3β还通过磷酸化Fyn（一种促进Nrf2核输出的酪氨酸激酶）间接限制Nrf2的作用。关键是，GSK3β介导的Nrf2调节作用独立于经典的Keap1介导通路。这一特性在对侧非卒中影响半球中很明显，尽管用SB216736治疗且β-Catenin升高，但该半球的Nrf2无显著差异。这是因为该对照半球缺乏氧化应激和ROS积累，不允许Nrf2从Keap1解离，这意味着可供GSK3β调节的胞质Nrf2有限。再次强调，大多数旨在治疗ICH的Nrf2提升研究都靶向其从Keap1的解离，从而促进胞质Nrf2水平。然而，如果其他调节因子如GSK3β积极促进其降解和核输出，通过这些方式实现的Nrf2作用可能受限。无论如何，在ICH的情况下，氧化应激和ROS积累应足以将Nrf2从Keap1释放。因此，通过抑制GSK3β介导的Keap1非依赖通路来维持Nrf2的作用在临床上可能比简单增加胞质水平更有效。
有趣的是，H67D小鼠未从SB216763治疗中获得任何额外的神经保护益处，表现为β-Catenin水平、功能运动恢复、血肿周围空间退行性神经元或抗氧化蛋白均无显著差异。值得注意的是，H67D-载体对照组小鼠已经表现出降低的GSK3β活性，如较高的β-Catenin水平所示。我们实验室先前的研究已观察到这些效应，即H67D原代星形胶质细胞与WT原代星形胶质细胞相比，β-Catenin水平高1.4倍，GSK3β活性降低（Song 2020）。因此，该通路可能已达到天花板效应，不再对单靠突变引起的增强刺激作出反应。尽管这些通路尚未完全阐明，但存在反馈回路和其他调节机制，可防止GSK3β过度抑制或Nrf2信号过度激活。
GSK3β是经典Wnt信号通路的主要参与者，该通路对细胞增殖等多种生物过程是必需的。在大脑中，Wnt信号在维持神经元功能和线粒体健康方面发挥重要作用。简言之，该通路在Wnt配体与Frizzled（Fz）受体结合时启动，然后招募支架蛋白Dishevelled（Dvl）。Dvl进而抑制GSK3β，导致胞质β-Catenin积累和基因转录改变（Sharma et al. 2024）。GSK3β的这种抑制也被证明通过阻止GSK3依赖性磷酸化和随后的蛋白酶体降解来增加Nrf2水平（Rada et al. 2015）。还存在两种主要的非经典Wnt信号通路。这些通路（Wnt/PCP和Wnt/Ca²⁺）独立于β-Catenin信号，主要改变细胞迁移和钙信号。重要的是，研究发现非经典Wnt通路在中枢神经系统损伤后被激活，并可能使经典通路失活（Park et al. 2015; Topol et al. 2003; Ackers and Malgor 2018; Niu et al. 2012）。由于SB216763选择性抑制GSK3β（经典Wnt通路的一部分），因此非经典通路的效应子可能正在限制该药物在H67D动物中的作用。然而，需要进一步的实验来确认H67D动物中非经典信号的可能差异。总之，这些因素提示存在额外的治疗靶点，可用于理解H67D动物ICH恢复的基因型差异。
总体而言，H67D HFE突变产生的先天神经保护是由于高铁的慢性暴露所致。这一概念在毒理学中被称为激素效应，表明低剂量的应激源能提供针对更高剂量相似应激的长期保护（Mattson 2008）。在H67D HFE突变的情况下，内源性较高的细胞内铁水平增加了氧化应激，最终诱导适应性抗氧化反应以限制ICH后的细胞损伤。我们的数据进一步表明，这种适应的一部分包括GSK3β通路的改变，最终可能赋予神经保护。该通路可在WT动物中进行操作，以模拟H67D动物中观察到的神经保护。然而，H67D动物在GSK3β抑制水平上未从此通路的药理学操作中获得额外的神经保护益处。
尽管这些结果意义重大，但仍有部分局限性需要考虑。首先是我们的研究仅测试了10 mg/kg剂量的SB216763，该剂量在先前研究中被发现有效且可耐受。更高的剂量可能在H67D动物中产生治疗效果，但代价是药物毒性。此外，我们没有进行假手术，因为我们最初的研究显示WT和H67D假手术条件之间的结果无差异。最后，我们的研究范式在ICH诱导前进行了14次SB216763注射。最终，这样做是为了通过确保目标在ICH前被最大程度抑制来确定GSK3β对ICH恢复的机制贡献。虽然这看起来可能不具有临床相关性，但一些ICH患者在初次出血后会经历再出血。因此，未来可能会在住院后对这些类型的药物进行预防性治疗某些ICH患者。
5 结论
我们的数据证实，GSK3β抑制通过增强抗氧化反应显著促进WT动物在ICH后的恢复，但对H67D动物中建立的基因型依赖性恢复没有贡献。这表明在GSK3β水平上对抗氧化反应的调节在H67D动物中已达到其生物学极限。因此，可能需要评估GSK3β通路上游的效应因子，以揭示H67D突变如何增强ICH后的恢复。最后，鉴于人类群体中H63D HFE突变的普遍性，这些数据强烈主张在ICH的临床试验或治疗策略中进行基因型分层，因为这种突变可能改变恢复，无论是否接受治疗。此外，H63D个体可能对GSK3β抑制研究无反应，而针对无此突变的人群，有前景的临床前研究可能证明其有益性。
作者贡献
Timothy B. Helmuth：概念构思、调查研究、资金获取、撰写初稿、方法学、验证、可视化、正式分析、数据管理。Kondaiah Palsa：概念构思、调查研究、验证、撰写审阅与编辑。Aurosman Pappus Sahu：概念构思、调查研究、撰写审阅与编辑。Elizabeth B. Neely：撰写审阅与编辑、调查研究、项目管理、方法学。Rashmi Kumari：调查研究、撰写审阅与编辑。Becky Slagle-Webb：调查研究、撰写审阅与编辑、方法学、项目管理。Scott D. Simon：概念构思、调查研究、资金获取、方法学、验证、可视化、撰写审阅与编辑、监督、资源。James R. Connor：软件、监督、资源、撰写审阅与编辑、概念构思、资金获取、方法学、调查研究。
致谢
Timothy B. Helmuth、Rashmi Kumari博士、Kondaiah Palsa博士、Aurosman Pappus Sahu、Elizabeth B. Neely、Becky Slagle-Webb、Scott D. Simon博士和James R. Connor博士为方法学做出了贡献；Timothy B. Helmuth和Scott D. Simon博士为调查研究做出了贡献；Timothy B. Helmuth起草了原稿，Rashmi Kumari博士、Kondaiah Palsa博士、Aurosman Pappus Sahu、Scott D. Simon博士、James R. Connor博士、Elizabeth B. Neely、Becky Slagle-Webb参与了稿件的审阅和编辑；Scott D. Simon博士和James R. Connor博士参与了监督工作。
基金
本研究由宾夕法尼亚州立大学神经外科系提供资金支持。
披露
作者无任何需要报告的内容。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。
同行评审
本文的同行评审历史记录可在Web of Science获取。
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