基于外泌体的方法在眼科恶性肿瘤再生医学与靶向治疗中的应用：综合综述
摘要
诊断和治疗眼部恶性肿瘤——如葡萄膜黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、眼内淋巴瘤和结膜肿瘤——由于其罕见性、复杂的病理生理学以及威胁视力或生命的高并发症风险而极具挑战性。传统治疗方法如化疗、放疗和手术，由于全身毒性、多药耐药性和局部控制不足，临床价值有限。外泌体——一种天然存在的、具有生物相容性结构的纳米级囊泡——代表了一个独特且有利的平台，能够将miRNA、蛋白质和/或基因编辑分子靶向递送并穿过眼部屏障，从而实现纠正性、持续性和靶向性的诊断、药物递送和免疫调节。间充质干细胞来源的外泌体在视网膜和眼部损伤的动物和人体模型中也显示出再生潜力，参与调节炎症和神经保护的生物学通路，如HMGB1和PI3K/AKT通路。尽管外泌体在眼科治疗应用中呈现出有前景的选择，但几个因素使其实际的临床转化复杂化，包括分离标准化、可规模化生产和监管问题。总体而言，随着合成和生物工程外泌体的不断引入，为临床可规模化且生物学可定制的外泌体疗法开辟了新的途径，基于外泌体的纳米医学可能成为精准治疗和再生眼科学的一个有希望的新方向。
引言
眼癌类型（原发性或继发性）原发性眼癌如葡萄膜黑色素瘤和视网膜母细胞瘤较为罕见。葡萄膜黑色素瘤通常影响脉络膜，尤其是在浅肤色人群中，如欧洲背景的人群。视网膜母细胞瘤主要影响儿童的视网膜，在全球范围内更为常见。继发性（转移性）眼肿瘤发生在患有全身性癌症的患者中。葡萄膜，特别是赤道后脉络膜，是眼部最常见的转移部位。产生眼部转移的原发性肿瘤最常见包括乳腺癌（37%）、肺癌（27%）、肾癌（4%）、胃肠道癌（4%）、皮肤黑色素瘤（2%）、肺类癌（2%）、前列腺癌（2%）、甲状腺癌（1%）、胰腺癌（1%）和其他癌症（3%）。原发性和继发性眼部恶性肿瘤将构成大多数临床相关病例，但由于其罕见性、病理生理学的复杂性以及威胁视力或生命的潜在并发症，在正确诊断和治疗方面提出了挑战。
葡萄膜黑色素瘤葡萄膜黑色素瘤是成人中最常见的原发性眼内癌。欧洲和美国的年发病率约为每百万人6例。与皮肤黑色素瘤类似，葡萄膜黑色素瘤与各种基因突变相关。与具有BRAF或NRAS突变的皮肤黑色素瘤不同，葡萄膜黑色素瘤由GNAQ或GNA11突变引起。危险因素包括BAP1肿瘤易感综合征、肤色浅、眼睛颜色浅、先天性眼黑变病和眼黑素细胞瘤。Lorigan等人对110名出现转移的葡萄膜黑色素瘤患者进行了一项研究。研究表明，92%的患者发生肝转移，其次是肺转移（31%）、骨转移（23%）、皮肤和皮下转移（17%）、淋巴结转移（14%）、脑转移（4%）、肾上腺转移（3%）、胃转移（2%）和脾转移（2%）。多达50%的初始葡萄膜黑色素瘤患者最终会出现远处转移。转移性播散通过血流发生，肝脏常受累。协作性眼黑色素瘤研究确定了5年累积转移率为25%，10年为34%。患者在初次诊断后长达20年内仍有发生转移的风险。
眼内淋巴瘤眼内淋巴瘤的总发病率预计占眼部恶性新生物的1.86%。淋巴瘤是一种罕见的眼内恶性肿瘤类型，可能约占眼科疾病的0.01%。大多数患者年龄超过50岁。大多数眼内淋巴瘤被归类为原发性玻璃体视网膜淋巴瘤，它影响视网膜色素上皮和玻璃体，而继发性淋巴瘤如转移性全身性淋巴瘤则累及葡萄膜。原发性玻璃体视网膜淋巴瘤是一种罕见的高级别结外非霍奇金淋巴瘤，影响玻璃体、视网膜，或在少数情况下影响视神经，但无脑实质受累。原发性玻璃体视网膜淋巴瘤发生在眼内腔室，没有任何脑部受累，是原发性中枢神经系统淋巴瘤的一个罕见亚组。原发性玻璃体视网膜淋巴瘤与原发性中枢神经系统淋巴瘤显著相关，因为大多数出现眼部受累的病例很可能进展为中枢神经系统淋巴瘤。当原发性中枢神经系统淋巴瘤首先影响视网膜时，称为原发性眼内淋巴瘤。大多数原发性玻璃体视网膜淋巴瘤病例代表高级别弥漫大B细胞淋巴瘤的形式。与原发性中枢神经系统淋巴瘤相似，原发性玻璃体视网膜淋巴瘤可归类为活化B细胞型淋巴瘤，更具体地说是ABC弥漫大B细胞淋巴瘤亚组。其特征是CD79和MYD88L265P频繁突变，并且与其他ABC亚组相比，预后往往较差。偶见不可分类的B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和T细胞淋巴瘤。原发性玻璃体视网膜淋巴瘤的病理生理学尚不完全清楚。淋巴瘤细胞的起源仍然未知；然而，与原发性中枢神经系统淋巴瘤相似，肿瘤细胞的转化很可能发生在中枢神经系统之外，然后迁移到眼睛并随后增殖。另一种独特的眼内淋巴瘤形式是原发性脉络膜淋巴瘤。眼部照射有导致白内障、放射性视网膜病变和视神经病变的风险，但在许多中心它是推荐的眼部治疗方法。玻璃体内化疗，即采用甲氨蝶呤400μg溶于0.1mL，通过密集的诱导-巩固-维持方案（在1年内注射25次），用于避免放射效应，但它存在角膜病变、黄斑病变和耐药性的风险。目前没有证据表明放疗比眼内化疗更有效。建议减少玻璃体内注射次数并延长注射间隔，以提高眼内化疗的可接受性。
结膜肿瘤结膜肿瘤是最常见的眼附属器和眼肿瘤之一。这组肿瘤包括良性病变如痣或乳头状瘤，以及恶性病变如表皮样癌或黑色素瘤，后者可能导致患者失明甚至死亡。结膜肿瘤包括广泛的诊断。三种最重要的恶性肿瘤是眼表鳞状细胞瘤（14%）、黑色素瘤（12%）和淋巴瘤（7%）。
视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤占所有儿童癌症的3%，是儿童中最主要的眼内恶性肿瘤。全球发病率报告为每15,000至23,000例活产婴儿中有1例。30-40%的病例表现为双侧肿瘤。在新诊断的视网膜母细胞瘤病例中，只有6%是家族性的，而94%是散发的。主要的临床表现是白瞳症（50%），其次是斜视（20%）。其他表现包括视力下降、疼痛性红斑眼、前房积血或眼球突出。
眼癌诊断与治疗的挑战眼癌在眼病中是独特的，危及视力和生命。通常，诊断是通过详细的临床病史和专门的眼科检查做出的。诊断眼癌很大程度上依赖于影像学方法，如高频超声、荧光素血管造影、光学相干断层扫描（用于前段和后段）、计算机断层扫描和磁共振成像。治疗方案取决于肿瘤的位置、大小、局部扩展、生长模式和继发性并发症。化疗是提高生存率的重要因素，在过去几十年中已经改变了视网膜母细胞瘤的治疗。治疗方案包括静脉注射化疗药物、通过眼动脉直接靶向肿瘤，以及最近用于治疗玻璃体种植的玻璃体内注射美法仑。常见的化疗通常靶向并破坏DNA，导致突变或基因组不稳定性，这是癌症和衰老的一个重要特征。许多化疗药物能以不同方式损伤DNA并干扰其功能，每种药物在体内表现不同，效果也不同。视网膜母细胞瘤的动脉内化疗最初由Kaneko及其同事在日本设计，作为一种保留视力的治疗方法，在那里眼球摘除在文化上不被接受。动脉内化疗存在争议。由于药物仅给予眼部，该手术应减少全身化疗问题。然而，在某些情况下出现中性粒细胞减少症表明药物具有全身效应。动脉内化疗通常可以治愈视网膜母细胞瘤。然而，该方法有其局限性，并不总是有效。动脉内化疗只治疗眼睛，这既是优点也是缺点。它靶向一个器官，但其明显无法控制全身转移是一个缺点。动脉内化疗可能比静脉全身化疗更易促进转移的发展。至少五分之一的视网膜母细胞瘤摘除眼具有高风险特征，需要辅助全身静脉化疗。诊断也有其挑战。对眼科医生来说，一个重要的临床问题是区分良性痣和需要及时治疗以改善预后的黑色素瘤。Carol Shields博士及其团队审查了Wills眼科医院肿瘤科的1329例病例，并确定了某些表明色素性斑点可能生长并且可能是需要治疗的黑色素瘤的体征。
外泌体在现代医学中的作用外泌体是纳米大小的、膜结合的细胞外囊泡，具有内体起源。它们在多泡体内形成，并在与质膜融合后释放，代表了细胞外囊泡中一个明确定义的亚类，参与细胞间通讯和分子运输。这些囊泡携带多种生物学货物，执行广泛的生理功能，也可用于诊断各种疾病。由于其固有特性，包括稳定性、生物相容性和保持不被发现的能力，外泌体被视为递送治疗药物的潜在有用工具。这一特性使外泌体能够在多种疾病的治疗中发挥作用，包括癌症。此外，外泌体表现出对挑战性环境条件（包括低血液pH）的抵抗力，使其成为癌症治疗中用于递送药物、核酸和显像剂的有前途的生物载体。外泌体作为抗癌药物（尤其是那些溶解度低且脱靶递送受限的药物）递送系统的潜力引起了相当大的兴趣。
整合再生医学与纳米技术在眼科肿瘤学中的应用纳米医学是指纳米技术在医学领域的应用，它有可能对癌症治疗产生重大影响。纳米医学是一个综合性的词汇，包括纳米尺度范围内的多种药物递送技术。为了实现医疗效益，纳米医学使用工程化的纳米设备和纳米结构来监测、控制、构建、修复、保护和改善人体生物系统，在分子水平上大规模并行地在单个细胞水平上进行。第一个纳米医学应用很可能出现在生物制药、可植入材料（组织再生支架、生物可吸收材料）、可植入设备和诊断工具中。人工视觉、微传感器和反馈设备、超高分辨率体内成像以及再生医学都将受益于纳米技术。含有基因转录因子和其他修饰化学物质的纳米颗粒被用于“再生纳米医学”，这是纳米医学的一个新领域，用于在体内修饰细胞。几乎每种原核和真核生物细胞都持续释放细胞外囊泡到细胞外空间，这些囊泡是各种各样的纳米级结构。细胞外囊泡由旨在递送到邻近或远处靶细胞的不同组分组成。它们有一个内部水性核心，由脂质双层膜保护。晚期内体运输机制产生外泌体，其直径在30至150 nm之间，蔗糖中的密度为1.13至1.19 g/mL。它们在称为多泡体的细胞器中细胞内产生，多泡体与质膜融合以将其释放到细胞外环境中。
外泌体：细胞通讯与治疗的关键角色
外泌体的生物发生与特征细胞释放一系列在大小和细胞内起源上不同的细胞外囊泡。这种多样性——连同非囊泡性的细胞外纳米颗粒——使定义单个分泌成分的组成和功能的努力复杂化。精确定位哪些RNA、DNA和蛋白质驻留在特定的细胞外区室中，并阐明它们是如何输出的，对于稳健的生物标志物发现和设计未来的药物干预至关重要。外泌体是小的细胞外囊泡，通常约30-150 nm，来源于内体系统，由大多数细胞类型产生。多样的RNA种类——mRNA、microRNA和其他非编码RNA——以及DNA和脂质，被主动和选择性地包装进多泡内体中的腔内囊泡内，这些是外泌体的前体。腔内囊泡是通过ESCRT机制以及辅助蛋白如ALG2相互作用蛋白X和肿瘤易感基因101的作用产生的。这些分子在多泡体膜上聚集泛素化蛋白，并支持内向出芽过程。形成后，多泡体可以与溶酶体融合进行降解，或与质膜融合以促进外泌体释放到细胞外空间。外泌体的生物发生示意图见图1。
多种生物学信号影响这些决策。外泌体通过多泡体与质膜融合的释放协调，促进了外泌体从细胞中释放，从而能够靶向邻近细胞或进入血液。几个因素调节外泌体的释放，包括细胞损伤如缺氧和炎症、环境变化，以及涉及生长因子和细胞因子的各种信号通路，这些通路可以抑制或促进外泌体内容的释放。外泌体的积累可能根据激活的特定信号通路上调或下调。由于其货物反映了亲本细胞的生理状态，外泌体是研究细胞功能和通讯模式的有价值的指标。外泌体形成、细胞内信号事件和外部条件之间复杂的相互作用强调了严格调控其产生以维持体内平衡和适应环境变化的重要性。这种调节平衡解释了为什么外泌体越来越被认为在正常生理和多种疾病过程中都有贡献。
外泌体是迷人的膜结构，封装了其来源细胞的特征。这些囊泡样结构包裹在脂质组成中，包含一系列生物活性物质，包括蛋白质、脂质和核酸。外泌体具有丰富的脂质组成，包括磷脂、胆固醇和鞘脂，有助于它们的稳定性、形态和大小确定。外泌体提供了一个迷人的维度，因为它们封装了遗传物质，包括mRNA和microRNA，有可能改变靶细胞中的基因表达。这种能力使它们能够介导关键的生物活动，包括免疫系统反应和细胞分化，同时促进各种过程。它们熟练地运输基本成分，对细胞的正常功能以及病理状况的诊断和治疗都有重要贡献。对外泌体的研究为细胞通讯机制提供了深刻的见解，并有望推进多种疾病的治疗策略。这有可能拓宽未来外泌体治疗的前景。这些和其他例子说明了自然界促进细胞间通讯的非凡而复杂的方式。
外泌体在癌症生物学中的双刃剑效应外泌体为癌症生物学提供了宝贵的见解，呈现出诊断和治疗的机会。通过细胞间通讯，外泌体在肿瘤进展、转移和疗法疗效中发挥重要作用。外泌体通常被描述为促癌因子，但不能排除它们在有些情况下可能具有抗肿瘤作用并减缓疾病发展。大量研究表明外泌体与癌症发展和进展之间存在显著关联。来自免疫细胞的外泌体可以抑制肿瘤生长、增殖和转移。外泌体在癌症免疫中发挥双重作用。围绕癌细胞的肿瘤微环境由癌症相关成纤维细胞、血管、神经纤维、免疫细胞、额外的基质细胞和携带不同遗传信号的细胞外囊泡组成。肿瘤微环境被认为建立了一个抑制恶性细胞无限制播散的环境，因为所有成分都倾向于抗癌性免疫抑制细胞。癌症和基质细胞之间的通讯网络是双向的，依赖于可溶性化合物如生长因子和外泌体的释放。已经证明癌症外泌体影响邻近细胞，从而促进肿瘤生长和转移。通过TGFβ依赖性方法，来自前列腺癌细胞的外泌体已被证明能刺激成纤维细胞分化为活化成纤维细胞或肌成纤维细胞。TGFβ+外泌体通过促进一种与血清TGFβ引起的肌成纤维细胞表型不同的肌成纤维细胞表型，突显了这两种细胞间通讯形式的不同功能。通过分泌生长激素、趋化因子和细胞外基质成分，活化的成纤维细胞——通常在肿瘤部位观察到——已知在肿瘤进展中发挥关键作用。癌症进展是一个动态的、多步骤的过程，其中许多广泛研究的信号事件促进了恶性肿瘤的进展。肿瘤来源的外泌体通过启动自分泌/旁分泌致癌作用、重编程基质细胞、影响免疫系统和刺激血管生成，积极影响癌症进展。Oncosomes是细胞外囊泡的一个特定亚型，最初被描述为由胶质瘤细胞释放的巨大囊泡。这些异常大的细胞外囊泡，直径1-10微米，其特点是含有异常货物，包括致癌蛋白。通过oncosomes在原发性肿瘤之间转移致癌化学物质，会诱导受体癌细胞发生形态转变，并增强其非锚定依赖性增殖。
转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞通过基底膜侵入血管、在血液中存活、粘附于血管壁、外渗，并最终在宿主器官中定植和生长。外泌体可能影响恶性肿瘤的转移特性，因为它们可以刺激多种瘤内生物学过程。转移性癌细胞释放的可溶性或囊泡结合生物活性分子，有助于在远处器官部位重塑细胞外基质结构，并重编程不同的贡献细胞，如肿瘤相关中性粒细胞、癌症相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞和骨髓祖细胞。在癌症转移之前，创建预转移微环境依赖于这一过程。
再生医学与眼科学中的外泌体
外泌体在组织修复与再生中的作用外泌体充满了独特的元素，有助于不同疾病模型中的愈合和更新。例如，miRNA可以通过调节下游信号级联如PI3K/AKT、MAPK和STAT3来促进组织再生，这些级联是细胞存活、抗炎和神经保护的核心。
目前，外泌体在软组织的修复和再生方面显示出令人鼓舞的治疗效果，包括肌腱、骨骼肌和周围神经。这些纳米颗粒及其类似物可以产生与细胞治疗相当的治疗效果，同时规避许多缺点。大多数实验证据表明使用外泌体的有效性和安全性，这是令人鼓舞的。外泌体通过多种方式促进软组织修复和再生。
间充质干细胞疗法在过去十年中得到了发展。由于间充质干细胞的再生、修复和免疫调节特性，它们在慢性眼病的细胞疗法中被广泛研究。有限的生物相容性、穿透性和对特定眼组织的转运限制了基于间充质干细胞的治疗。利用间充质干细胞来源的外泌体作为药物递送方法的潜在优势可以得到充分发挥，因为它们可能具有更强的能力穿过诸如血-视网膜屏障等屏障，这是从其已证明的穿过血脑屏障的能力推断出来的。此外，它们的货物受到保护免于降解，从而在眼组织中产生增强的生物利用度。
用于视网膜和角膜损伤的外泌体衍生疗法损伤、感染或缺血对视网膜细胞造成的损害会引发邻近神经细胞的变性，导致形态和功能上视网膜损伤的增殖以及不可逆的视力损害。
外泌体因其结构组成、多样的生物学作用和独特的生物学来源，成为有前途的天然药物载体。有证据表明，外泌体可以作为被动和主动药物递送的载体，展示出多种特性和组分。此外，已知外泌体在许多疾病中发挥重要作用，如癌症、心血管疾病和神经系统疾病。近年来，关于不同细胞来源的外泌体在一系列眼部疾病中的功能的研究越来越多。然而，关于外泌体如何参与眼部疾病，我们知之甚少。关于外泌体在眼部疾病中作用的研究最近才出现。Zhang等人回顾了关于外泌体在眼部疾病（包括年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、自身免疫性葡萄膜炎、青光眼和视神经夹伤）中作用的几项研究。此外，他们的综述讨论了如何获取外泌体，以及它们作为治疗载体的潜力。Yu等人进行的研究表明，由间充质干细胞产生的外泌体可以在激光诱导的视网膜损伤动物模型中减少炎症和视网膜损伤。此外，Mead等人研究了细胞外囊泡在视网膜疾病如视神经夹伤、青光眼、视网膜缺血、激光损伤、自身免疫性葡萄膜炎和糖尿病视网膜病变中的治疗潜力。
间充质干细胞有潜力控制炎症反应并促进伤口愈合。外泌体已被证明有助于这一修复过程。它们成功限制新生血管形成并增加中性粒细胞清除，从而产生无瘢痕的角膜修复。在受损角膜中，外泌体增加抗血管生成因子和抗炎细胞因子的表达，同时降低促炎因子的表达。由间充质干细胞产生的外泌体由于其抗炎、抗血管生成和免疫调节能力，在角膜损伤的治疗中显示出巨大的前景。外泌体可以通过增加细胞增殖、减少细胞死亡和促进角膜上皮恢复来改善角膜伤口愈合。它们还可以通过减少中性粒细胞浸润和纤维化相关基因激活来减少炎症和瘢痕形成。此外，间充质干细胞来源的外泌体可以通过抑制促血管生成因子来减少角膜血管生成，并通过减少炎症细胞因子表达来加速角膜伤口愈合。这些特性使得间充质干细胞来源的外泌体成为治疗各种角膜疾病和病症的有前途的方法。间充质干细胞来源外泌体在减少炎症、促进上皮修复和抑制角膜新生血管形成中的作用见图2。
基于外泌体的眼癌靶向治疗
外泌体作为药物递送系统：优势与局限性外泌体因其结构组成、多方面作用和独特起源，代表了一类有前途的天然药物载体。研究表明，外泌体可以通过被动和主动机制运输多种药物。外泌体可以通过将其结合到其膜上的四跨膜蛋白上来增强药物的稳定性和功效。外泌体可以包含有益的化合物，包括外源蛋白，促进其穿过诸如血脑屏障等屏障，从而为神经系统疾病提供可能的治疗方法。此外，外泌体可以运输CRISPR/Cas9组分进行基因编辑，促进基因编辑功能在细胞间的转移。除直接效应外，自体外泌体可以增强药物在体内的分布和功效。
它们可以作为功能RNA链、DNA分子、肽或合成药物的纳米载体。源自生产AAV-2的293T细胞的外泌体在玻璃体内注射后，显示出比标准AAV-2更优越的视网膜转导效率。这说明了外泌体在眼部药物治疗中的能力。尽管如此，关于将外部功能性货物整合到外泌体中用于治疗眼部疾病的研究还很缺乏，这突显了在眼科领域开发此类疗法需要实质性进展。
此外，已观察到负载外源miRNA-126的间充质干细胞外泌体通过抑制高迁移率族蛋白B1信号通路来减轻高血糖引起的视网膜炎症。
外泌体凭借其生物学特性，可以封装并将小分子化疗药物和生物分子递送到受体组织或器官。与其他合成纳米药物载体相比，它们具有更好的器官趋向性、归巢能力、细胞摄取和货物释放能力。在肿瘤中分泌的外泌体可作为无毒、无免疫原性的药物递送载体，用于各种癌症，尤其是在缺氧和酸性的肿瘤微环境中。
它们可以帮助肿瘤细胞逃避免疫监视并促进免疫耐受，但免疫细胞来源的外泌体也可以阻止肿瘤细胞的生长、增殖和转移。
像免疫细胞一样，癌细胞可以产生具有免疫活性的外泌体，这可以改变免疫调节系统。携带肿瘤抗原的外泌体表现出抗肿瘤特性。这些外泌体可以通过利用CD8+和CD4+ T淋巴细胞来根除恶性肿瘤。此外，它们能够立即阻止肿瘤的生长和发展。
另一方面，外泌体也与对多种抗癌治疗的耐药性有关。因此，必须全面评估外泌体在癌症进展、耐药性中的作用，以及将外泌体用作癌症治疗递送系统的可能性。
将外源性药物有效装载到外泌体中对于将其用作药物载体至关重要；然而，这项任务在研究外泌体作为药物载体的功能化时提出了一个挑战。目前，已经通过超声处理、电穿孔、转染、孵育、挤出、转基因、皂苷辅助装载、冻融循环、热应激、pH梯度技术和低渗透析等方法将药物装载到外泌体中。
眼癌是复杂的疾病，需要仔细管理以挽救患者生命并保护视力。最常见
的眼内癌是儿童和成人中的恶性新生物。视网膜母细胞瘤是一种常见的儿童眼内癌，通过动脉内化疗在治疗方面取得了最新进展。葡萄膜黑色素瘤是最常见的成人眼内恶性肿瘤，治疗主要基于质子束疗法或碘-125放射性 plaque 近距离放射治疗。
连接外泌体来源、货物谱、作用机制和眼部靶细胞的概念性总结见表1。
外泌体在葡萄膜黑色素瘤诊断和治疗中的应用约50%的葡萄膜黑色素瘤患者会发生转移性肝病，这通常在一年内致命。由于转移灶对免疫检查点抑制剂或化疗的敏感性较低，更好地了解肿瘤免疫学和代谢可能会催生新的治疗方法。
一项研究检查了玻璃体液和细胞外基质与葡萄膜黑色素瘤中miRNA失调相关的方面。研究发现，玻璃体液外泌体中miRNA谱改变的主要原因是miRNA，表明它们参与了致癌信号传导。玻璃体液、血清和外泌体中miR-146a水平升高，证明了miRNA谱分析用于葡萄膜黑色素瘤诊断的可能性。该研究强调了基于外泌体的miRNA作为葡萄膜黑色素瘤中的治疗靶点和生物标志物，着重描述了它们在细胞间通讯和葡萄膜黑色素瘤发病机制中的作用。
此外，Achberger等人最近表明，葡萄膜黑色素瘤患者血浆以及CD3+、CD56+和CD15+细胞中的miR-146a水平高于对照组。
根据一项研究，源自葡萄膜黑色素瘤细胞系的葡萄膜黑色素瘤细胞外囊泡能够在体内转化NOD-SCID小鼠并导致癌症。在人类BRCA1缺陷成纤维细胞中，靶细胞暴露于葡萄膜黑色素瘤细胞外囊泡后表现出恶性转化。此外，该研究发现葡萄膜黑色素瘤细胞外囊泡对于靶细胞的表型改变至关重要。蛋白质组学分析证实了它们的黑素细胞起源，显示与肝转移和癌发生相关的蛋白质升高。原发性葡萄膜黑色素瘤细胞外囊泡的蛋白质组谱与转移性葡萄膜黑色素瘤细胞外囊泡不同，表明前者参与转移微环境的创建、肿瘤细胞的侵袭、迁移和增殖。
葡萄膜黑色素瘤细胞外泌体在肿瘤的发生和扩散中起着关键作用。它们通过诱导生长因子释放、细胞因子产生和细胞信号通路来促进葡萄膜黑色素瘤细胞的运动和侵袭。巨噬细胞迁移抑制因子是这一过程中的重要介质。阻断巨噬细胞迁移抑制因子可抑制黑色素瘤细胞运动，强调了其在转移中的重要性。根据这些结果，在葡萄膜黑色素瘤中阻止转移的治疗方法可能涉及靶向外泌体货物，特别是巨噬细胞迁移抑制因子。
重要的是要认识到外泌体表现出双重和上下文依赖的性质。虽然黑色素瘤来源的外泌体可以通过转移致癌miRNA和蛋白质来促进肿瘤生长、血管生成和转移，但间充质干细胞来源的外泌体表现出相反的行为，支持抗炎和再生反应。这些对比效应主要源于其细胞来源和分子货物的差异，包括肿瘤相关与修复性信号分子。因此，外泌体在眼部恶性肿瘤中的治疗应用需要仔细表征和生物工程，以在利用其再生和靶向递送潜力的同时最小化致癌风险。外泌体介导的诊断和预后机制示意图见图3。
在接受肝灌注的肝转移性葡萄膜黑色素瘤患者中，Eldh等人从肝脏灌注液中分离出外泌体。当黑色素瘤来源的外泌体在转移性葡萄膜黑色素瘤中释放到肝脏循环时，它们含有Melan-A和黑色素瘤相关的microRNA，进一步确定了它们的来源。
外泌体在视网膜母细胞瘤诊断和治疗中的应用常规组织活检不适合视网膜母细胞瘤，因为有可能发生转移和眼外肿瘤播散。由于液体活检（如血液）具有非侵入性、易于获取且已知含有肿瘤标志物，因此它们被用于循环细胞外囊泡和肿瘤细胞的现代研究中。多个研究小组已经表明，细胞外囊泡，特别是外泌体，通过穿透微环境，参与了视网膜母细胞瘤肿瘤的生长。外泌体货物，包括蛋白质和miRNA，已被证明在视网膜母细胞瘤中失调，并可能用作预测和诊断标志物以及可能的治疗靶点。
值得注意的是，在视网膜母细胞瘤肿瘤外泌体中发现的23种蛋白质与视网膜母细胞瘤肿瘤和血清中下调的hsa-miR-9和上调的hsa-miR-494共享靶点。这进一步证明了miRNA调控在视网膜母细胞瘤癌发生中的复杂性。对外泌体形成及其在视网膜母细胞瘤和其他眼部恶性肿瘤病理生理学中的作用进行广泛研究，将有助于新的诊断和治疗方法。在血液中发现相关的疾病特异性外泌体或其成分可以极大地帮助诊断需要侵入性手术的视网膜母细胞瘤。治疗过程中外泌体的微小变化也将有助于简化药物和剂量。与其他恶性肿瘤相比，视网膜母细胞瘤和其他眼部肿瘤中的外泌体尚未得到深入研究。对眼泪蛋白质组的了解也不充分。
一项研究检测了血清外泌体miRNA作为可能的视网膜母细胞瘤指标。即使在使用更大队列进行确认后，某些miRNA（如hsa-miR-301b-3p和hsa-miR-216b-5p）在视网膜母细胞瘤患者的血清外泌体中未检测到表达，尽管发现它们在视网膜母细胞瘤组织中显著升高。根据这些结果，血清外泌体miRNA可能不是视网膜母细胞瘤预后的准确指标。该研究建议转而研究其他液体，如玻璃体液或脑脊液，这些液体对特定miRNA显示出令人鼓舞的结果（图4）。
Galardi等人最近研究了源自原发性视网膜母细胞瘤组织和玻璃体种植细胞系的外泌体的蛋白质组成。他们的目标是识别与玻璃体种植过程相关的生物标志物和治疗候选物。分析显示几种蛋白质水平升高，如TLN、β3整合素和GSTM1。这些分子在重塑细胞外基质、改变葡萄糖和氨基酸代谢以及驱动肿瘤侵袭和转移中发挥作用。它们还与干细胞特性和化疗耐药性有关。此外，外泌体携带其他蛋白质，包括ABI2、NCAN、ATP6V1C1和UBXN4，这些与细胞生长和肿瘤发展密切相关，突显了它们在视网膜母细胞瘤进展中的相关性。此外，ABI2可能在视网膜母细胞瘤中作为肿瘤抑制因子发挥作用，因为研究表明它抑制细胞增殖，而其截短变体则促进恶性肿瘤的进展。在葡萄膜黑色素瘤和视网膜母细胞瘤中，当前的诊断生物标志物存在重要局限性，限制了早期和微创检测。在葡萄膜黑色素瘤中，细针穿刺活检虽然提供信息，但存在肿瘤种植、取样不足和手术相关并发症的风险，这限制了其常规使用。同样，在视网膜母细胞瘤中，可靠的组织获取很困难，因为玻璃体采样本身受到限制，并且可能无法完全代表肿瘤异质性。此外，血清生物标志物通常缺乏敏感性和特异性，使其在早期诊断或监测方面不可靠。外泌体分析有助于克服这些问题，它能够在可获取的生物体液（如血清、血浆或玻璃体液）中检测肿瘤来源的miRNA和蛋白质，与常规方法相比，提供了一个微创、可重复的平台，具有更高的分子稳定性和诊断精度。
表2总结了针对眼癌的常规和新兴外泌体治疗策略。
临床转化中的挑战在临床环境中将外泌体用于眼部疾病时，最显著的问题之一是缺乏公认的分离和纯化标准。分离是一个重大挑战。尽管存在不同的工艺，但目前仍缺乏一致的方法来制造临床级别的细胞外囊泡。将细胞外囊泡靶向特定细胞是另一个挑战。尽管驱动靶向过程的参数尚未完全了解，但表面化学物质、靶细胞的生理状态和给药途径是重要影响因素。已经开发了几种使用外泌体模拟物递送核酸的技术。一种策略是通过逐步挤压非致瘤性MCF10A细胞通过不同孔径的过滤器，然后通过电穿孔封装小干扰RNA，来生成大小可控的外泌体模拟物。
最近的进展进一步突显了工程化外泌体和细胞外囊泡介导的CRISPR递送在眼科药物开发中的独特优势和剩余局限性。虽然CRISPR-Cas9能够实现精确的基因编辑，但由于脱靶风险、免疫原性以及病毒和纳米颗粒载体有限的肿瘤亲和力，其安全高效地穿过眼细胞膜仍然是一个主要挑战。工程化外泌体在这些领域提供了重要改进：它们的生物相容性、固有的靶向能力和高装载能力支持更有效地转移基因编辑复合物。此外，表面修饰的外泌体已显示出增强的内化作用和对限制性肿瘤微环境改善的抵抗力。外泌体模拟物还通过提供可规模化生产和减少批次变异性（与天然囊泡相比）来解决关键的转化障碍。然而，尽管有这些优势，关键问题——包括递送效率、潜在的免疫相互作用、货物稳定性和制造可重复性——仍未解决，表明这些技术虽然前景广阔，但在用于眼科基因治疗的可靠临床应用之前仍需大量优化。
缺乏工业标准限制了来自不同来源的外泌体的商业化，这些外泌体表现出不同的特性，需要特定的制造规程和质量控制标准。此外，在生产与递送过程中必须密切监控外泌体的稳定性、安全性、效力和总体质量。因此，他们提出了一套标准来处理所有这些问题，这将需要技术突破以及政府和行业之间的监管合作。一组研究人员建议，跨研究标准化外泌体的剂量和效力将提高数据的可靠性，使政府能够在标准化情况下制定规则。尽管生产效率高，但他们承认不断变化的联邦标准仍然给临床转化带来困难。然而，随着外泌体变异性的显现，他们预测外泌将变得更可重复，更容易用于生物疗法。
未来前景与挑战
外泌体生物学研究可以推动科学进步，使基于外泌体的药物发挥作用，并找出制造合成外泌体的方法。合成外泌体虽然尚未得到彻底研究，但提供了一种生成具有特定结构、内容和活性的外泌体的手段，从而促进临床转化和逆向工程。
尽管外泌体具有优势，但在临床应用中面临挑战，如靶向效率低和易被免疫系统吞噬。分离纯化方法耗时费力，其异质性取决于产生它们的细胞类型。
装载了特定分子（如miRNA、siRNA和重组蛋白）的治疗性外泌体可以提供最佳生物利用度和最小免疫排斥。然而，它们复杂的组成和功能活性可能限制其临床应用。
每毫升培养基产生的外泌体少于1微克。使用标准细胞培养方法，外泌体可以生产12小时。然而，生物反应器可以提高产量。正确储存外泌体至关重要；例如，在-80°C下储存比在更高温度下储存能更好地保持其形态。给药后的生物分布非常重要。
通过制造能在特定生理条件下控制释放的外泌体，基于外泌体的药物可能会效果更好、副作用更少。在储存产品时，研究使其更稳定的配方（包括稳定物质或更好的冻干方法）至关重要。研究长期保质期和稳定性也至关重要。靶向策略、混合系统和体内性能对进步也至关重要。
外泌体疗法最大的问题之一是缺乏标准的装载和大规模生产方法。天然外泌体具有某些独特的生物学优势，但分离和制备它们仍然困难、昂贵且不可靠。一个新的选择是制造人工纳米载体，如合成脂质体。它们非常接近天然外泌体的结构和功能。这些合成系统具有明显的商业优势，如更高的产量、更好的质量控制、可重复性以及在工厂中大规模使用的能力。但是，尽管进行了更多研究，大规模外泌体生产仍然存在一个主要问题。问题在于满足临床前研究、临床试验和最终商业化的需求。为了解决这些问题，研究人员正在研究使用三维搅拌罐生物反应器的细胞培养系统。这些研究提供了适合医疗应用的受控和持续的外泌体生成。在基于外泌体的治疗药物开发中，最关键的挑战之一是纯化。研究环境中常用的传统方法，如超速离心或沉淀，往往会留下大量工艺和产品相关的杂质。这种污染降低了最终制剂的可靠性和安全性，使其不适合临床级应用。为了解决这一差距，迫切需要先进的纯化技术。这些技术不仅要有可扩展性，还要高度精确，确保生产的囊泡具有满足临床试验中人类使用监管标准所需的纯度。
组织培养生物反应器和其他技术使得制造足以在医院使用的外泌体变得更加容易。现成的外泌体产品在-20°C下能保持稳定是一个好迹象。由自体树突状细胞制成的外泌体在临床试验中显示出安全性和有效性的前景，特别是在治疗癌症方面。然而，挑战依然存在，如安全性评估、统一的生产指南和理想的剂量建议。
在一项研究中，由Expi293F细胞制成的细胞外囊泡在治疗应用中是安全的，即使在High剂量下，在体外和体内均未显示毒性。该研究发现细胞外囊泡可作为有效的生物递送载体用于药物。
许多临床前研究已经评估了来自异种和同种异体来源的外泌体在细胞治疗中的免疫原性、安全性和有效性，尽管这些方面尚未被彻底定义。令人鼓舞的是，鉴于研究表明在异体和自体治疗中疾病均有改善，使用来自此类细胞来源的外泌体的临床前研究在应用于临床环境时可能更有效地克服监管障碍。外泌体可以运输多种药物，使其成为癌症治疗中递送抗肿瘤药物和基因工具的有前途的平台。此外，一些关于外泌体分子谱分析的临床研究已经在进行中，这可能很快有助于精准医学。
结论
基于外泌体的方法标志着眼癌和再生眼科学的一个革命性框架。外泌体作为天然纳米载体，在靶向药物递送、免疫调节和细胞间通讯方面具有独特的优势，有助于眼部癌症（包括葡萄膜黑色素瘤和视网膜母细胞瘤）的精准治疗，同时减少全身毒性。此外，源自间充质干细胞的外泌体由于其抗炎和神经保护特性，在视网膜和眼组织的修复中表现出显著的再生能力。尽管取得了这些进展，基于外泌体的疗法的临床转化仍然有限，主要由于未解决的挑战，如大规模生产、标准化分离技术、异质性控制和监管复杂性。通过跨学科合作和先进生物工程来解决这些差距，可以释放其全部临床潜力。未来的举措应集中于优化生物工程方法以提高装载效率和靶向特异性，同时建立强大的制造和质量保证流程。随着持续的研究、临床验证和技术进步，外泌体有望从有前景的实验工具发展成为个性化、再生性眼部疾病疗法的实用、安全和有效的组成部分。
缩写
AAV-2，腺相关病毒2型；ALIX，ALG2相互作用蛋白X；AMD，年龄相关性黄斑变性；CAF，癌症相关成纤维细胞；CNS，中枢神经系统；COMS，协作性眼黑色素瘤研究；CRISPR/Cas9，成簇规律间隔短回文重复序列/Cas9；DR，糖尿病视网膜病变；ESCRT，运输所需内体分选复合物；EVs，细胞外囊泡；EXO，外泌体；HMGB1，高迁移率族蛋白B1；IAC，动脉内化疗；IFN，干扰素伽马；IL，白细胞介素；ILVs，腔内囊泡；miRNA，微小RNA；MSC，间充质干细胞；MSC-EXO，间充质干细胞来源外泌体；MVB，多泡体；MVEs，多泡内体；ONC，视神经夹伤；OSSN，眼表鳞状细胞瘤；RB，视网膜母细胞瘤；sEVs，小细胞外囊泡；siRNA，小干扰RNA；TAM，肿瘤相关巨噬细胞；TGF，转化生长因子贝塔；TME，肿瘤微环境；TSG101，肿瘤易感基因101；TSP-1，血小板反应蛋白-1；UM，葡萄膜黑色素瘤；VEGF，血管内皮生长因子；VH，玻璃体液。
披露
作者声明本工作无利益冲突。
致谢
我们还要感谢伊玛目霍梅尼、穆罕默德·克尔曼沙希和法拉比医院的临床研究发展中心，该中心隶属于克尔曼沙赫医科大学，感谢他们的友好支持。
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