摘要
背景：
Lp-PLA2将氧化脂质代谢与血管炎症联系起来，但在中东人群中的数据仍然有限。本研究评估了沙特队列中循环Lp-PLA2、炎症细胞因子、氧化脂质和全血mRNA表达。
方法：
进行了一项病例对照研究，包括30名已确诊动脉粥样硬化性心血管疾病(CVD)的男性和30名无已知CVD的男性。使用ELISA测量血浆生物标志物，并使用RT-qPCR评估Lp-PLA2、IL-6和TNF-α的全血mRNA表达。进行了多变量线性回归分析，调整了BMI、LDL-C、HbA1c和吸烟因素。
结果：
与非CVD参与者相比，CVD患者显示出更高的Lp-PLA2(419±188 vs. 101±32 ng/mL; P<0.001)、IL-6(74±17 vs. 40±19 pg/mL; P<0.001)、TNF-α(4.4±0.9 vs. 3.7±0.8 pg/mL; P<0.01)、ox-LDL(430±143 vs. 242±67 ng/mL; P<0.001)和LP-a(134±31 vs. 90±33 nmol/L; P<0.001)，以及更具动脉粥样硬化性的脂质谱(LDL 3.02±0.63 vs. 1.72±0.63 mmol/L; P<0.001; HDL较低: P<0.01)。Lp-PLA2、IL-6和TNF-α的mRNA表达在CVD中上调。Lp-PLA2与IL-6(r=0.75, P<0.001)、TNF-α(r=0.36, P<0.01)、ox-LDL(r=0.85, P<0.001)和LDL(r=0.80, P<0.001)相关。然而，在多变量回归分析中，LDL-C和HbA1c是生物标志物水平的显著预测因子。尽管在调整后LDL-C和HbA1c与生物标志物水平相关，但无法排除与疾病状态和治疗暴露相关的残留混杂因素。
结论：
CVD中升高的炎症和氧化生物标志物与基础代谢因素（特别是血脂异常和血糖状态）密切相关。这些发现支持Lp-PLA2作为脂质相关炎症活性的标志物，而非独立的致病介质。本研究提供了来自沙特队列的人群特异性数据，并强调了在解释心血管生物标志物时考虑代谢背景的重要性。
引言
心血管疾病(CVD)是由失调的脂质代谢、持续的血管炎症和不良适应性组织重塑之间复杂相互作用驱动的，目前仍是全球发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化是大多数CVD的病理基础，现在被越来越多地认为是一种炎症性疾病，其中脂蛋白的氧化修饰和免疫激活共同促进斑块的形成和发展。
炎症与脂质氧化之间关系中的一个重要分子是脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)，它也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)或VIIA组磷脂酶A2，由PLA2G7基因编码。Lp-PLA2是一种主要由巨噬细胞和其他炎症细胞产生的分泌型、钙非依赖性丝氨酸水解酶。它在血液中主要与低密度脂蛋白(LDL)分子结合，小部分与高密度脂蛋白(HDL)结合。
氧化LDL(ox-LDL)是血管炎症和动脉粥样硬化斑块形成的重要因素。脂蛋白内源性抗氧化剂被耗尽，包括被酶氧化系统(如脂氧合酶、髓过氧化物酶和NADPH氧化酶)和非酶自氧化过程作用，促进了多不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化。这些反应产生脂质过氧化物和反应性醛类，修饰载脂蛋白B和LDL的磷脂成分，产生具有不同脂质含量和不同受体结合特性的异质ox-LDL分子。
ox-LDL被白细胞清除受体优先识别，如簇分化36(CD36)、清除受体-A(SR-A)和氧化凝集素样LDL受体-1(LOX-1)，促进其细胞摄取并刺激细胞内炎症信号传导。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)分子与这些受体的结合激活了关键炎症通路，包括IKK-IκB-NF-κB和应激反应性丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路(ERK1/2、JNK和p38)等几条轴。这种激活反过来刺激多种途径，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和Lp-PLA2等炎症介质的转录，进而导致巨噬细胞中脂质积聚和泡沫细胞形成。
Lp-PLA2通过分解ox-LDL上的氧化磷脂，产生溶血磷脂酰胆碱(LPC)和氧化非酯化脂肪酸(oxNEFA)等副产物。这些脂质介质对内皮细胞产生促炎作用，促进巨噬细胞释放细胞因子，并放大氧化应激，共同形成一个整合的炎症网络，将氧化脂质负担与持续的血管炎症和斑块发展联系起来。
根据大型观察性研究和荟萃分析的结果，循环Lp-PLA2质量或活性的增加与亚临床动脉粥样硬化的发生、不利斑块特征的存在以及冠心病(CHD)和缺血性卒中风险的升高密切相关。即使在控制传统心血管危险因素的情况下，这种关联仍然成立。然而，Lp-PLA2质量和酶活性捕获了部分不同的生物信息，可能根据脂蛋白分布、底物可用性和炎症状态而有所不同。组织病理学和影像学研究进一步证明，Lp-PLA2在动脉粥样硬化斑块的巨噬细胞丰富、脂质富集区域富集，并与氧化修饰的LDL共定位，支持其与坏死核心形成和斑块易损性的关联。
尽管存在这些关系，Lp-PLA2在动脉粥样硬化中的功能仍未完全阐明。在包括STABILITY和SOLID-TIMI 52在内的大规模III期临床研究中，Lp-PLA2的药理学抑制剂darapladib未能显著降低严重不良心血管事件，同时有效抑制酶活性。同时，针对东亚人群中常见的PLA2G7基因功能丧失变异体(如V279F无效等位基因)的遗传研究产生了不一致或可忽略的相关性。
这些结果表明，Lp-PLA2可能主要作为疾病活动的标志物或以情境依赖的方式发挥作用，而不是动脉粥样硬化的普遍致病因素。最近的研究进一步强调了脂质代谢、炎症信号传导和心血管风险在不同人群之间的相互作用。
实验研究提供了Lp-PLA2衍生脂质介质可能促进血管炎症的生物学上合理的机制。LPC和某些oxNEFA已被证明可促进内皮活化、上调粘附分子和炎症细胞因子、损害内皮屏障功能和血管舒张，并调节巨噬细胞和血管平滑肌细胞表型。重要的是，Lp-PLA2的生物效应似乎取决于其脂蛋白载体。LDL相关的Lp-PLA2可能优先在动脉壁内产生促炎脂质介质，而HDL相关的Lp-PLA2在特定条件下被认为可能参与氧化磷脂的解毒。LP-a脂蛋白在血管环境中的丰富度进一步使氧化磷脂的丰度复杂化，这可能影响Lp-PLA2活性后的炎症后果。
基于这些发现，许多重要问题需要解答，例如底物可用性和载体脂蛋白类型如何影响Lp-PLA2在活体内的活性，这种酶的脂质介质如何调节在血液中循环的免疫细胞中的炎症信号传导，以及Lp-PLA2何时仅是疾病负担标志物而并非真正参与动脉粥样硬化的病理生理学。特别是对于在心血管生物标志物研究中仍然代表不足的社区，解决这些差异至关重要。
因此，本研究旨在比较动脉粥样硬化CVD患者与非CVD参与者的循环Lp-PLA2蛋白水平、全血基因表达以及炎症细胞因子和脂质过氧化标志物。本研究使用生化、炎症和分子技术评估与沙特心血管疾病相关的脂质氧化和炎症通路。
方法
设计和参与者
这项比较性病例对照研究在沙特阿拉伯萨卡卡国王阿卜杜勒阿齐兹专科医院进行。研究人群包括30名动脉粥样硬化CVD男性(平均年龄55±8岁)和30名非CVD男性(平均年龄53±14岁)。本研究特意仅选择男性参与者。在沙特社会中，男性吸烟率明显高于女性；因此，将招募限制在男性有助于更精确地表征与动脉粥样硬化性心血管疾病相关的吸烟相关代谢和炎症危险因素，同时减少与性别相关的行为变异性。心血管疾病中与性别特异性差异相关的脂质代谢和炎症反应已被充分证实。将参与者限制在男性旨在减少此探索性队列中的异质性；然而，这种方法限制了普遍性，未来研究应包括两性。
根据诊断和临床记录，许多动脉粥样硬化心血管疾病患者伴有共病性代谢和心血管疾病，如糖尿病、血脂异常、高血压和超重或肥胖，且大多数是前吸烟者。相比之下，无已确诊CVD的参与者虽然有一些心血管代谢危险因素，包括吸烟、高血压和糖尿病。动脉粥样硬化心血管疾病患者根据常规临床实践进行处理，如诊断记录和治疗方案所示。许多患者接受了用于血糖调节的二甲双胍，以及旨在降低血压和胆固醇水平的药物。从CVD患者在心脏病中心和健康志愿者在护理中心采集血浆样本。从研究期间在实验室分析完成前死亡的参与者那里获得的样本被排除在外。项目No. (2023 127)获得了沙特阿拉伯Al Qurayyat卫生事务部卫生部研究伦理委员会和国家生物伦理和医学委员会(H 13 S 071)的机构审查委员会(IRB)批准。
血液收集、处理和储存
按照常规实验室技术，从空腹过夜的患者和健康对照组采集静脉血并离心。将等分的血浆制备用于立即进行常规血液学和生化分析，以及用于后续心血管生物标志物检查的-80°C储存。为避免干扰生物标志物测量，通过肉眼检查排除并筛选出显示明显溶血(粉红色至红色血浆变色)的样本。
生化和血液学分析
医院临床实验室使用酶法分光光度测定法评估血脂谱，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、LDL-C和HDL-C。进行丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐和尿素的测量，以进一步了解肝肾功能。还测量了全血细胞计数(CBC)和血红蛋白水平的参数。
心血管、炎症和氧化生物标志物
为分析TNF-α、IL-6、FABP3、ox-LDL、Lp-PLA2和LP-a等多个参数，此第二血浆样本在-80°C下保存直至分析。使用ELISA试剂盒(Elabscience®, Houston, Texas, USA)根据制造商提供的方法测试所有生物标志物。批内和批间变异系数<5%，支持高分析精度。
Lp-PLA2 (PLA2G7) mRNA表达的RT-qPCR
为进行基因表达分析，将全血收集在EDTA管中。使用RNA纯化试剂盒(Genaxxon bioscience, Germany)提取总RNA。通过分光光度法(A260/A280比值)评估RNA浓度和纯度；需要在可接受范围内的值才能继续。使用来自德国Genexxon Bioscience的Scriptase RT cDNA试剂盒在20μL反应中使用无RNase水生成第一条链cDNA。逆转录在50°C进行10分钟，随后95°C进行10分钟以使逆转录酶失活。使用AriaMx仪器(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)进行RT-PCR，并设计使用以下引物，列于补充材料中。所有反应使用PCR主混合物(Genaxxon Bioscience)以一式两份进行。GAPDH作为归一化参考基因，并按指定包括为校准器。相对表达通过2^-ΔΔCt方法计算。
统计分析
连续变量表示为平均值±标准差(SD)。使用视觉检查和适当的统计测试评估正态性。对于正态分布变量，使用独立t检验进行组间比较，必要时使用非参数检验。使用Pearson或Spearman方法评估相关性。为了考虑潜在的混杂因素，以Lp-PLA2、IL-6和TNF-α作为因变量进行多变量线性回归分析。协变量根据生物学相关性预先选择，包括体重指数(BMI)、LDL-C、HbA1c和吸烟状态。鉴于样本量较小(n=60)，使用简约模型以最小化过拟合。回归结果表示为β系数与95%置信区间(CI)。双侧P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
基本人口统计学和临床特征
表1总结了标准人口统计学和临床参数。虽然两组间年龄无差异，但非CVD参与者与CVD患者之间的体重指数(BMI)存在显著差异(29±5 vs. 26±1 kg/m²; P=0.01)。吸烟暴露在CVD组中更为频繁。心血管代谢共病—包括高血压、糖尿病和血脂异常—在CVD患者中高度普遍，而在非CVD参与者中较少见。已确立的心血管疾病和心血管药物仅限于CVD队列。
基线：临床、生化和血液学特征
如表2所示，CVD患者表现出明显更不良的代谢谱。CVD患者的空腹血糖高于非CVD参与者(10.8±3.5 vs. 5.8±1.5 mmol/L; P=0.001)。血脂谱明显具有致动脉粥样硬化性—TC 4.2±0.6 vs. 3.6±0.5 mmol/L(P<0.001)、LDL C 3.0±0.6 vs. 1.8±0.6 mmol/L(P<0.0001)和较低HDL 1.1±0.1 vs. 1.3±0.3 mmol/L(P<0.001)；甘油三酯在两组间相似。肝肾指标在CVD中略高(ALT 38±30 vs. 22±7 IU/L, P<0.05；肌酐107±24 vs. 81±12 μmol/L, P<0.001；尿素10±5 vs. 4.8±1.2 mmol/L, P<0.01)。血液学特征：CVD表现出促炎性血液谱，白细胞计数更高(WBC 10.6±5.0 vs. 7.0±1.6×10³/μL; P<0.001)、中性粒细胞增多(65±11% vs. 47±11%; P<0.0001)和相对淋巴细胞减少(22±11% vs. 40±10%; P<0.0001)。红细胞指数不同(MCV、MCH更高；MCHC更低；所有P≤0.01)，而平均血小板体积(MPV)降低(8.0±1.2 vs. 10±0.6 fL; P<0.001)。
炎症和氧化生物标志物
在表3中，在整个生物标志物组中，CVD患者具有更高的IL-6(74±17 vs. 40±17 pg/mL; P<0.0001)、更高的TNF-α(4.3±0.9 vs. 3.6±0.8 pg/mL; P<0.0001)、更高的ox-LDL(430±147 vs. 242±66 ng/mL; P<0.0001)、更高的LP-a(134±31 vs. 90±33 nmol/L; P<0.0001)和明显更高的Lp-PLA2(419±185 vs. 101±31 ng/mL; P<0.0001)。FABP3趋向更高但无统计学意义(3.4±1.0 vs. 3.1±0.1 ng/mL; P=0.073)。
多变量回归分析
在表4中，针对BMI、LDL-C、HbA1c和吸烟进行调整的多变量线性回归模型显示，LDL-C和HbA1c是Lp-PLA2和炎症生物标志物的一致显著预测因子。然而，无法排除与疾病状态和治疗暴露相关的残留混杂因素。LDL-C与Lp-PLA2和IL-6强相关，而HbA1c独立预测Lp-PLA2和IL-6水平。吸烟与IL-6和TNF-α相关。调整后，分类CVD状态未保留在最终模型中作为独立预测因子。
蛋白质-mRNA分析之间的相关性
在表5中，Lp-PLA2在蛋白质和转录物水平上均观察到一致的差异：蛋白质419±185 vs. 101±31 ng/mL(P<0.0001)；mRNA 1.243±0.102 vs. 1.021±0.130(P<0.0001)。在CVD内，蛋白质-mRNA相关性显著(r=0.627; P<0.001)；在非CVD参与者中则不显著(r=0.19; P<0.2)。IL-6：蛋白质74±17 vs. 40±17 pg/mL(P<0.0001)；mRNA 1.920±0.340 vs. 1.213±0.381(P<0.0001)。在CVD中强烈的蛋白质-mRNA耦合(r=0.778; P<0.0001)，在非CVD参与者中则不显著(r=0.24; P=0.1)。TNF-α：蛋白质4.3±0.9 vs. 3.6±0.8 pg/mL(P<0.01)；mRNA 1.25±0.10 vs. 1.05±0.15(P<0.0001)。CVD中的蛋白质-mRNA相关性显著(r=0.612; P<0.001)；在非CVD参与者中则不显著(r=0.17; P<0.2)。总体而言，这些发现表明Lp-PLA2、IL-6和TNF-α的转录活性与循环蛋白水平之间的耦合是疾病依赖性的，在CVD中存在但在非CVD参与者中较少见。
Lp-PLA2浓度与循环脂质谱、炎症和氧化生物标志物之间的关联
在汇总生化数据中，Lp-PLA2与TNF-α(r=0.36; P<0.01)、IL-6(r=0.75; P<0.0001)、LP-a(r=0.71; P<0.0001)、ox-LDL(r=0.85; P<0.0001)、TC(r=0.64; P<0.0001)、LDL(r=0.80; P<0.0001)、TG(r=0.19; P=0.146)呈强正相关，并与HDL呈负相关(r=-0.44; P<0.00)。这些发现将Lp-PLA2与致动脉粥样硬化脂蛋白和全身炎症激活联系起来。
讨论
本研究表明，已确诊动脉粥样硬化性心血管疾病的个体表现出循环水平和全血mRNA表达的Lp-PLA2、IL-6和TNF-α升高，同时伴有增加的氧化脂蛋白和致动脉粥样硬化脂质谱。此外，这些发现与心血管疾病中失调的脂质代谢、氧化应激和全身炎症之间的既定关联一致。
本研究中观察到的IL-6和TNF-α水平升高与先前将这些细胞因子确定为血管炎症和心血管风险关键标志物的报告一致。这两种细胞因子已知参与NF-κB和JAK/STAT等炎症信号通路，导致内皮功能障碍和免疫激活。然而，在本研究中，多变量回归分析表明，这些关联主要由基础代谢因素解释，特别是LDL-C和血糖状态，而不仅仅是疾病状态。这表明循环细胞因子升高可能反映了更广泛的代谢和炎症环境，而不是作为动脉粥样硬化疾病的独立指标。
同样，Lp-PLA2水平升高及其与LDL-C、ox-LDL和Lp(a)的显著相关性与先前强调其在脂质氧化和炎症交叉点功能的研究一致。Lp-PLA2分解氧化磷脂，产生具有生物活性的脂质介质，如溶血磷脂酰胆碱和氧化脂肪酸，这些已被与炎症信号传导联系起来。然而，本研究确定的Lp-PLA2与LDL-C之间的强独立相关性证实了Lp-PLA2主要表示脂质相关的炎症负担，而不是动脉粥样硬化的独立致病介质这一概念。这一解释与临床和遗传研究一致，这些研究表明Lp-PLA2抑制对心血管结果的影响最小。
重要的是，本研究的一个显著发现是，在控制BMI、LDL-C、HbA1c和吸烟后，LDL-C和HbA1c是Lp-PLA2和炎症生物标志物最可靠的显著预测因子，而分类CVD变量并未持续存在。结果表明，组间生物标志物差异主要受基础代谢功能障碍影响，而不仅仅是疾病状态。这强调了在分析心血管研究中的炎症和氧化生物标志物时考虑心血管代谢背景的必要性。
Lp-PLA2、IL-6和TNF-α的蛋白质水平和全血mRNA表达的同时增加表明炎症通路的同步激活。然而，在解释全血mRNA数据时需要谨慎。全血基因表达既表明转录调控，也表明循环白细胞组成的波动。然而，在本研究中，CVD患者表现出中性粒细胞增多和相对淋巴细胞减少，这可能影响评估的表达水平。因此，观察到的mRNA表达增加不能归因于细胞特异性上调，也不直接反映血管壁内的基因表达。
药物使用是影响解释的另一个重要因素。此外，CVD队列表现出他汀类药物和抗糖尿病治疗的显著患病率，这两种药物都因其影响脂质和炎症生物标志物的能力而闻名。由于药物使用和疾病状态密切相关，它们的独立效应无法完全区分。
需要注意几个局限性。小样本量降低了其功效和普遍性。仅允许男性参与使其对女性的适用性降低。尽管进行了多变量调整，但代谢负担和药物使用相关的残留混杂仍有可能。全血mRNA表达也显示了白细胞的组成，但并未显示特定细胞或血管中的基因表达。此外，对照组并非完全没有心血管代谢危险因素，需要仔细解释。
结论
总之，已确诊动脉粥样硬化性心血管疾病的个体表现出增加的循环和转录炎症和脂质氧化指标，如Lp-PLA2、IL-6和TNF-α。然而，这些关联主要由基础代谢因素解释，包括血脂异常和血糖状态，而不仅仅是疾病状态。这些结果验证Lp-PLA2作为脂质相关炎症活性的指标，并强调了代谢背景在心血管生物标志物解释中的重要性。后续具有增强混杂变量控制和细胞特异性分析的纵向研究对于阐明机制关系是必要的。这些发现应谨慎解释，因为无法排除残留混杂因素。
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