一种饮食补充剂保护衰老肌肉
细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的氧化形式对线粒体功能至关重要，其补充可以延长寿命。Zhang等人发现，给衰老小鼠喂食NAD+前体烟酰胺核糖(NR)可以保护它们免受肌肉退化（参见Guarente的观点）。NR处理增强了肌肉功能，也保护小鼠免于肌肉干细胞的损失。该处理同样保护了神经干细胞和黑色素细胞干细胞，这可能有助于延长NR处理动物的寿命。
摘要
成体干细胞(SCs)对组织维持和再生至关重要，但在衰老过程中易发生衰老。我们证明了细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化形式的数量及其对线粒体活性的影响是调节肌肉干细胞(MuSC)衰老的关键开关。使用NAD+前体烟酰胺核糖(NR)处理诱导了线粒体未折叠蛋白反应和prohibitin蛋白的合成，从而使老年小鼠的MuSC恢复活力。NR还在肌营养不良症的小鼠模型mdx (C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J)中防止了MuSC衰老。此外，我们证明NR延迟了神经干细胞和黑色素细胞干细胞的衰老并延长了小鼠寿命。保护细胞NAD+的策略可能重新编程功能失调的干细胞并改善哺乳动物的寿命。
在成年人中，组织稳态高度依赖于干细胞(SC)功能。成体干细胞不仅对持续增殖的组织（如造血、肠道和皮肤系统）至关重要，也对通常处于静止状态的组织（如骨骼肌和大脑）至关重要，这些组织在受损或暴露于疾病后需要再生(1)。衰老伴随着成体干细胞功能的下降，称为干细胞衰老，这导致组织稳态和再生能力的丧失(2, 3)。
骨骼肌的稳态和再生依赖于通常处于静止状态的肌肉干细胞(MuSCs)，这些细胞在肌肉受损时被激活，增殖并产生分化的成肌细胞，从而再生受损的肌纤维(4, 5)。这些反应在老年肌肉中减弱，可能是因为MuSCs数量和功能的减少(6-8)。在衰老过程中，MuSC功能障碍可能由外部信号(9, 10)、内在细胞衰老信号通路(11)或两者共同引起。细胞衰老的一个普遍调节因子——细胞周期依赖性激酶抑制剂2A(CDKN2A，也称为p16INK4A)在老年MuSCs中表达增加，这导致非常老年小鼠(28至32个月大)的细胞周期永久退出和MuSCs衰老(11)。然而，MuSC数量和功能的减少在此阶段之前就已能观察到(6, 11)，表明MuSC衰老可能在更早的时间点就开始了。约2岁的前老年小鼠可能表现出MuSC衰老的特征(8, 12-15)。然而，引发MuSC衰老的早期机制在很大程度上仍不清楚。
生物体衰老的一个标志是线粒体功能障碍的出现(2, 3)。由高热量饮食或衰老引起的线粒体功能障碍可能是由于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)氧化形式的耗竭，而使用烟酰胺核糖(NR)等前体补充NAD+可以逆转这一过程(16-20)。干细胞被认为主要依赖糖酵解获取能量，这一过程会降低细胞内NAD+浓度(21)。线粒体功能与干细胞的维持和激活相关(22-25)，但其在衰老中的作用尚不清楚。
线粒体功能障碍是MuSC衰老的生物标志物
为了确定线粒体功能在干细胞中的作用，我们比较了年轻和老年小鼠的MuSCs。为了识别引发MuSC衰老的主要机制，我们使用基因集富集分析(GSEA)检查了公开可用的年轻(~3个月)和老年(~24个月)小鼠MuSC基因表达数据集；基因表达综合库(GEO)登录号GSE47177、GSE47104和GSE47401。年轻与老年小鼠数据集的富集评分显示，随着年龄增长，衰老通路被上调，细胞周期通路被下调。这一发现与不可逆的细胞周期停滞是细胞衰老的主要标志这一观点一致(2, 3)。在所有三个数据集中，三羧酸(TCA)循环和氧化磷酸化(OXPHOS)通路是老年MuSCs中最被下调的通路之一。对在老年MuSCs中显著下调的基因本体论术语的分析进一步证实了与线粒体功能的联系。在衰老过程中共同下调的基因与线粒体基因显示出大量重叠(113个基因；11.59%)，而与共同上调的基因和线粒体基因的重叠最小(11个基因；1.92%)。在老年MuSCs中下调的113个线粒体基因中，41.6%与TCA循环和OXPHOS相关，这高于它们在整个线粒体蛋白质组中的百分比组成(~14%)。这表明老年MuSCs中线粒体呼吸基因的表达显著下降。线粒体OXPHOS和TCA循环基因的减少在所有独立数据集中都是一致的。我们分离了原代老年和年轻MuSCs，并证实了OXPHOS和TCA循环转录本的丰度降低，以及在新鲜分离的和培养的MuSCs中氧化呼吸速率降低。老年小鼠中MuSC线粒体功能障碍进一步通过线粒体膜电位的丧失和细胞三磷酸腺苷(ATP)浓度的降低得到证实。线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)的几个重要标志物和调节因子（一种介导线粒体含量和功能适应的应激反应通路）在老年MuSCs中被下调。尽管CDKN2A或丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14，也称为p38)通路没有发生一致的变化（先前报道这些通路调节MuSC衰老），但细胞周期基因的表达减少，而编码衰老促炎分泌组的基因表达增加。细胞周期信号的减少伴随着细胞周期依赖性激酶抑制剂1(CDKN1A；也称为p21CIP1)介导通路中基因表达的增加，这表明MuSCs的早期衰老可能涉及CDKN1A。
NAD+补充改善老年小鼠的MuSC功能
鉴于NAD+浓度在控制线粒体功能中的重要性(16, 29)，我们研究了NAD+补充改善老年小鼠MuSC数量和肌肉功能的潜力。新鲜分离的MuSCs中，老年小鼠的NAD+含量较低，而6周的NR处理增加了年轻和老年小鼠MuSCs中的NAD+浓度。NADH（NAD+的还原形式）的含量相对稳定。与年轻动物相比，老年小鼠的肌肉中含有更少的MuSCs。然而，NR处理增加了年轻和老年小鼠的MuSC数量。通过已知的MuSC标志物配对框蛋白Pax-7(PAX7)染色证实了MuSC数量的增加。在年轻和老年小鼠中，NR的效果似乎不是由肌肉或体重的变化引起的，因为在短时间治疗期间，这些指标在所有组之间保持可比性。NR处理还通过一种直接作用于肌纤维的独立机制增强了老年动物的肌肉功能(16)，从老年小鼠最大跑步时间和距离以及肢体抓握力的改善可以看出这一点。年轻动物没有显示这种变化。
肌肉再生效率的损害已与老年小鼠中MuSC功能的下降相关联(6)。因此，我们研究了NR对心肌毒素(CTX)诱导的肌肉损伤的肌肉再生的益处(4)。NR处理加速了老年和年轻小鼠的肌肉再生。NR诱导的再生改善伴随着老年小鼠中PAX7染色MuSCs的增加，但在年轻小鼠中没有。NAD+补充还改善了老年MuSCs的干性，如MYOD1和PAX7双阳性肌纤维与PAX7阳性肌纤维比率的降低所示，因为MYOD1是一种激活MuSC分化的转录因子。CTX诱导损伤后7天，接受NR处理的老年小鼠表现出胚胎肌球蛋白重链阳性的纤维水平升高，这是一种在胎儿和新再生的成年肌纤维中表达的蛋白质。然后将MuSCs从NR处理或对照老年小鼠移植到mdx小鼠中（杜氏肌营养不良症的小鼠模型，由于持续肌肉再生的压力，随着年龄增长逐渐失去MuSC功能）。从NR处理的供体中分离的MuSCs在移植到年轻或老年mdx受体时，更有效地补充了MuSC区室并刺激了dystrophin阳性肌纤维的肌生成。因此，NR处理可以改善肌肉再生和MuSC移植效率。
据报道，非肌源性纤维-脂肪祖细胞(FAPs)和炎症细胞的不当积累会损害MuSC功能和肌肉再生，尤其是在老年或慢性损伤的肌肉中，如在mdx小鼠中发现的(31)。NR处理在CTX诱导损伤后7天大幅减轻了老年小鼠FAP数量的增加，但在基础条件下对FAPs没有影响。这一发现与在肌肉再生后期FAP清除的益处一致(31)。NR还在CTX诱导再生后7天减轻了老年小鼠的巨噬细胞浸润。
NR通过改善线粒体功能防止MuSC衰老
为了解释NAD+补充后老年动物MuSCs的改善，我们研究了对MuSC衰老的影响。对NR处理的年轻和老年小鼠新鲜分离的MuSCs进行免疫染色，检测组蛋白2A.X在Ser139处的磷酸化(γH2AX)，这是DNA损伤的标志物(2)。老年动物MuSCs中γH2AX染色的细胞核更为丰富，而NR处理减少了染色。通过单细胞凝胶电泳(comet)试验确认了MuSCs中核损伤反应的减少，这是一种敏感的DNA链断裂测量方法，作为衰老的指标，以及通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色，另一种经典的衰老标志物(2)。对晚期传代C2C12成肌细胞进行6小时NR处理也降低了细胞衰老和凋亡标志物的表达(32)。从NR处理的老年小鼠中分离的MuSCs显示出形成成肌集落的潜力增强。因此，NR对内在MuSC衰老具有保护作用。
烟酰胺核糖处理老年小鼠的MuSCs降低了编码CDKN1A和相关促炎蛋白的mRNA丰度，并增加了细胞周期基因的表达。这些效应在年轻动物的非衰老MuSCs中未观察到。NR处理老年动物的MuSCs增加了其产物在TCA循环和OXPHOS中发挥作用的基因表达，这种效应在年轻动物中不明显。为了量化不同条件下的蛋白质表达水平，我们应用了一种新的基于质谱的蛋白质组学技术，即顺序窗口化采集所有理论片段离子质谱(SWATH-MS)(33)，该技术允许在样本队列中进行准确和可重复的蛋白质定量。使用这种技术，我们能够量化各种条件下MuSCs中1100多种蛋白质的表达变化。SWATH-MS结果显示，老年动物MuSCs中在OXPHOS和UPRmt中发挥作用的大量蛋白质减少。双向方差分析(ANOVA)检验后，NR补充后这些相同蛋白质的总量增加，P < 0.05。对老年动物新鲜分离的MuSCs进行蛋白质免疫印迹分析，证实了细胞周期和衰老相关蛋白质的表达增加，这些蛋白质无法通过SWATH-MS检测到。
用NR处理的老年小鼠的肌肉干细胞表现出氧化呼吸的增加。来自老年动物的NR处理MuSCs也显示出线粒体膜电位增加和ATP丰度增加。为了测试NR对MuSC衰老的这种保护作用是否依赖于线粒体功能，我们通过将SIRT1flox/flox小鼠与Pax7creER品系杂交，创建了他莫昔芬可诱导的sirtuin-1(SIRT1)MuSC特异性敲除小鼠(SIRT1MuSC−/−)。SIRT1是一种NAD+依赖性脱乙酰酶，可增加线粒体生物发生(16)。NR对CTX注射后肌肉再生的有益作用在SIRT1MuSC−/−小鼠中似乎减弱。支持这一定性观察，敲除MuSCs中的SIRT1阻断了NR对MuSC激活和衰老的有益作用，再生后7天。这些数据表明，NR通过SIRT1依赖的方式改善线粒体功能来抑制MuSC衰老。这一发现与一项报告一致，该报告将FOXO3(一种SIRT1靶标)的激活与造血干细胞中改善的线粒体代谢联系起来(34)。
通过激活UPRmt和prohibitin通路使MuSC恢复活力
我们通过研究prohibitin（一组应激反应蛋白）的作用，进一步探索了UPRmt如何调节衰老。Prohibitin感知线粒体应激并在哺乳动物的成纤维细胞中调节衰老(35)，在酵母中维持复制寿命(36)，并在缺乏成体干细胞的蠕虫中促进长寿(37)。在生物信息学分析中，prohibitin Phb和Phb2的表达降低，在新鲜分离的老年MuSCs中也是如此。添加NR增加了C2C12成肌细胞中prohibitin蛋白的表达以及年轻和老年小鼠MuSCs中的转录本。NR处理也被证明同时增加了UPRmt和细胞周期标志物的prohibitin表达。此外，prohibitin的过表达，即使没有NR，同样增加了UPRmt和细胞周期蛋白的表达。通过敲低prohibitin后NR处理未能改善UPRmt和细胞周期蛋白表达，证明了NR效应对prohibitin的依赖性。为了确认prohibitin对细胞周期蛋白的调控并探索prohibitin对MuSC功能的影响，通过肌肉内注射shPhb慢病毒在体内耗竭Phb（PHB和PHB2仅作为杂合蛋白复合物发挥功能）(38)。在CTX诱导的肌肉再生后7天，观察到shPhb慢病毒注射小鼠的肌肉再生受损和MuSC数量减少。量化这些结果，Phb敲低显示阻断了再生过程中NR诱导的MuSCs增加。Phb敲低不会在老年小鼠中诱导更多MuSC衰老，但会阻止NR对MuSC衰老的有益作用。通过thiamphenicol启动UPRmt也在C2C12细胞中诱导了prohibitin和细胞周期基因的表达。这些结果表明，NR在抑制MuSC衰老的同时激活了UPRmt和prohibitin信号通路。
NR重新编程mdx小鼠中易衰老的MuSCs
由于持续的肌肉再生，mdx小鼠的MuSCs在年轻时异常活跃，导致晚年MuSC耗竭和功能障碍。因此，从14周龄mdx小鼠分离的原代MuSCs比对照小鼠更强烈和频繁地被β-Gal染色，并且细胞大小更大。与老年动物中的效应类似，NR处理mdx小鼠在体内将MuSC数量增加了约1.8倍，PAX7免疫染色也证实了这一点。随着MuSCs的增加，NR处理后再生的肌纤维也增加。我们通过检查mdx小鼠中MuSCs的自我更新能力扩展了这一分析。随着MuSCs的分化，细胞氧化还原比率下降(39)，这可以通过450-nm自发荧光的增加来检测(40)。与NR增加mdx小鼠中MuSCs数量一致，我们发现从这些动物分离的MuSCs的自发荧光减少。我们对从体内经NR处理或未经NR处理的mdx小鼠分离的原代MuSCs进行了β-Gal染色，然后在体外进一步用或不用NR培养。从NR处理小鼠分离的MuSCs不易衰老。当从对照mdx小鼠分离的MuSCs在体外用NR处理时，衰老也减少。NR处理的mdx小鼠中MuSC衰老的抑制通过γH2AX和裂解caspase-3免疫染色的减弱得到证实。为了评估MuSC功能，在NR处理的mdx小鼠中检查了CTX诱导的肌肉再生。与预防MuSC衰老一致，NR在老年和年轻mdx小鼠中都改善了肌肉再生。我们还检查了NR对mdx小鼠中FAP群体和肌肉再生的影响。NR处理在基础条件下和CTX诱导损伤后7天增加了MuSCs并减少了FAP数量。mdx小鼠中FAPs的异常激活导致纤维化(31)。用CTX处理然后暴露于NR的mdx小鼠在损伤后7天显示出较低水平的巨噬细胞浸润。因此，我们的结果表明NR对mdx小鼠中的MuSC功能和再生具有有益效果。
NR减轻神经和黑色素细胞干细胞的衰老并延长小鼠寿命
衰老伴随着神经干细胞(NSCs)数量和功能的下降(23)以及黑色素细胞干细胞(McSCs)的下降(41)。因此，为了检查NAD+稳态在体细胞干细胞中的普遍重要性，我们评估了NR对老年小鼠NSCs的影响。NR增加了增殖，如5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EdU)和抗原Ki-67(Ki67)染色所示，并诱导了神经发生，如双皮质素(DCX)染色所示，在老年小鼠的侧脑室下区(SVZ)和海马齿状回中。烟酰胺单核苷酸，另一种NAD+前体，在老年NSCs中也具有有益效果(23)。同样，NR挽救了老年小鼠毛囊中McSCs的下降，这反映在NR处理的老年小鼠中已知的McSC标志物mast/stem细胞生长因子受体Kit(c-KIT)和短暂受体电位通道2(TRP2)的增加。NR处理C57BL/6J小鼠略微延长了寿命(普通饮食：平均829 ± 12.0天；NR处理：平均868 ± 12.4天；P = 0.034)。NR对生存的有益效果通过Cox比例风险分析进一步得到证实。尽管寿命益处很小，但它是在24个月（晚年）开始NR治疗时获得的，这表明衰老可能部分源于一般干细胞NAD+稳态的失调。
结论
氧化应激，可能由线粒体呼吸引起，被认为通过干细胞主要依赖糖酵解作为能量来源而被避免(42)。然而，我们的研究表明，线粒体氧化呼吸对多种成体干细胞在衰老过程中的功能维持很重要。事实上，细胞NAD+池的减少削弱了适应性UPRmt通路(18)，最终导致线粒体稳态丧失，同时MuSCs数量和自我更新能力下降。因此，通过提高MuSC中NAD+的浓度，由于UPRmt通路的激活，蛋白毒性应激抵抗可能得到恢复，刺激线粒体应激传感器和效应器的prohibitin家族。反过来，这种效应将改善线粒体稳态，保护MuSCs免于衰老，并保护老年小鼠的肌肉功能。通过使用Sirt1的MuSC特异性功能丧失模型（一种调控线粒体稳态的基本调节因子）(43)，NAD+-SIRT1通路、线粒体活性和MuSC功能之间的关系的重要性及其关键性质在体内得到了明确确立。此外，通过补充NAD+储备来维持健康的线粒体似乎对MuSCs以外也有有益效果，似乎也能保护NSC和McSC群体免受衰老。
我们的结果表明，导致线粒体功能障碍的prohibitin信号抑制可以通过营养干预来逆转，以提高干细胞中NAD+的浓度。此外，我们的发现表明，NAD+补充可能被证明是延长哺乳动物寿命的一种有吸引力的策略。
致谢
H.Z.、D.R.、K.J.M.、J.A.和EPFL已就使用NAD增强来增强干细胞功能提交了临时专利申请。我们感谢T. Langer分享Phb质粒；S. Wang和M. Knobloch在McSC和NSC实验中的技术帮助；感谢H. Li、L. Mouchiroud、P. Moral Quiros以及Auwerx和Schoonjans团队的所有成员进行有益的讨论；感谢EPFL组织学和流式细胞术核心设施的技术支持。H.Z.是中国国家留学基金管理委员会博士奖学金和CARIGEST SA奖学金的获得者。D.D.得到了意大利癌症研究协会奖学金的支持。K.J.M.得到了渥太华大学和加拿大心脏与中风基金会的支持。J.A.是雀巢能量代谢讲席教授，他的研究得到了EPFL、美国国立卫生研究院（资助R01AG043930）、瑞士癌症研究/瑞士癌症联盟（资助KFS-3082-02-2013）、Systems X（资助SySX.ch 2013/153）和瑞士国家科学基金会（资助31003A-140780）的支持。
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