尽管在预防、药物和治疗策略方面取得了显著进展，冠状动脉疾病（CAD）仍然是全球医疗体系和经济的重大挑战。研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）可通过影响免疫反应、内皮细胞和血管平滑肌细胞功能以及脂质代谢，在CAD的发展中发挥重要作用。通过对GEO数据集（GSE42148）的分析，我们确定了CAD患者中的差异表达基因（DEGs）和lncRNA（DELs）。我们进行了功能富集和通路分析以阐明这些DEGs的作用，并构建了lncRNA-mRNA相互作用网络来研究DEGs与DELs之间的相互作用。通过实时PCR验证，我们发现LINC00963和SNHG15在CAD患者中显著上调。值得注意的是，LINC00963水平在有家族病史、高血脂、高血压和糖尿病的患者中显著升高，而SNHG15在吸烟者中的表达更高。此外，LINC00963和SNHG15的表达与个体年龄呈显著负相关。ROC曲线分析表明，这两种lncRNA作为生物标志物具有高敏感性和特异性。因此，本研究提出LINC00963和SNHG15可能是CAD早期检测的有价值标志物，尤其是在年轻个体中。
材料与方法
微阵列数据收集与差异表达分析
从NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中检索了mRNA和lncRNA的转录组数据，使用数据集GSE42148。该数据集包括13名经血管造影确诊的CAD患者和11名无症状对照组。利用GEO2R工具检测CAD组和对照组之间的差异表达基因（DEGs）和lncRNA（DELs）。差异表达的基因基于|log2FC| ≥ 1且p值<0.05的标准进行筛选。
功能富集分析
为了研究潜在的生物学机制，使用DAVID工具对已识别的DEGs进行了基因本体（GO）和KEGG通路分析。GO分析重点关注三个主要类别：分子功能（MF）、细胞组分（CC）和生物过程（BP）。统计显著的通路根据其富集得分和相关p值进行选择。
lncRNA-mRNA网络构建
使用Cytoscape构建了lncRNA-mRNA相互作用网络，以探索DEGs和DEL之间的功能相互作用。每个lncRNA通过StarBase平台寻找mRNA靶点。
研究人群
本研究得到了霍尔木兹甘医科大学伦理委员会的批准（批准编号：“IR.HUMS.REC.1403.303”），并遵循《赫尔辛基宣言》。所有参与者均签署了知情同意书。研究对象包括50名经诊断患有CAD的患者和50名健康个体。
RNA提取与cDNA合成
每位参与者抽取10 mL血液，使用EDTA抗凝管防止凝血。按照制造商的协议，使用RNX Plus™试剂盒提取总RNA。为去除任何DNA污染，RNA样品用RNase-free DNase处理。RNA的质量和完整性通过Thermo Scientific™ NanoDrop 2000分光光度计评估，并通过DNase I处理和2%琼脂糖凝胶电泳进一步验证。随后，每个样品的2.0 µg RNA用于cDNA合成。
实时定量PCR
实时定量PCR（qRT-PCR）在10 µL体积中进行（三重复），使用Mic qPCR系统和SYBR Green master mix。分析了SNHG15和LINC00963的基因表达水平，以内参基因SRSF4为基准。所用引物序列详见表1。
统计分析
所有数据以平均值±标准差（SD）表示，至少来自三个独立重复实验。使用SPSS软件版本27.0和GraphPad Prism版本8.0进行统计评估。Mann-Whitney U检验用于组间比较，结果在P < 0.05时视为统计显著。Spearman相关系数用于相关性分析。
结果
微阵列数据分析与差异表达分析
通过GEO2R工具对GSE42148数据集进行差异表达分析，共分析了62,972个基因，其中171个显著下调，458个显著上调。这些基因基于|log2FC| ≥ 1和p值<0.05的标准进行识别。
CAD患者与健康对照相比，322个蛋白编码基因和25个lncRNA表现出差异表达。火山图显示了这些转录变化，红色代表上调基因，蓝色代表下调基因，灰色代表不显著基因。
功能富集分析
GO富集分析揭示了CAD相关的DEGs在BPs、MFs和CCs方面的显著富集，提供了涉及CAD的分子和细胞机制的见解。关键的BPs包括由RNA聚合酶II调控的转录增强、炎症反应、信号传导和细胞间信号传导。此外，其他重要过程包括肿瘤坏死因子生成的上调、T细胞增殖、轴突延伸和细胞生长及转录的下调。在MF类别中，富集术语强调了蛋白质结合、DNA结合转录激活活性、肽激素结合和CXCR趋化因子受体结合的重要性。KEGG通路富集分析识别出与CAD显著相关的几个关键通路，包括IL-17信号通路、Ras信号通路和癌症相关通路。
lncRNA-mRNA网络构建
使用Cytoscape构建了lncRNA-mRNA相互作用网络，以探索DEGs和DEL之间的功能相互作用。每个lncRNA通过StarBase平台寻找mRNA靶点。在25个DEL中，17个与mRNA靶点有相互作用。进一步分析了lncRNA与DEGs mRNA之间的调控相互作用，构建了lncRNA-mRNA网络。这一分析识别出8个关键lncRNA（包括LINC00963、PVT1、GABPB1-AS1、MIR34AHG、MIR4435-2HG、ZNF667-AS1、ST20-AS1和SNHG15），它们靶向基因并调节其表达。在8个关键lncRNA中，基于其在网络中的中心性、新颖性以及我们在类风湿关节炎（RA）和系统性红斑狼疮（SLE）等炎症性疾病中的先前研究，选择了LINC00963和SNHG15进行验证。
患者中LINC00963和SNHG15的表达
qRT-PCR验证了LINC00963和SNHG15在患者和对照组中的表达。结果表明，与正常样本相比，CAD患者中的LINC00963和SNHG15表达均上调。在CAD样本中，LINC00963和SNHG15表达分别比对照组高出5.91倍（P < 0.0001）和2.30倍（P < 0.0001）。
进一步分析显示，在患有高血脂、高血压和糖尿病的患者中，LINC00963表达显著高于正常条件下的患者（P < 0.05）。此外，有CAD家族史的患者LINC00963表达显著更高（P < 0.05）。然而，在吸烟者和非吸烟者之间没有差异。
另一方面，SNHG15在高血脂、高血压、糖尿病和有CAD家族史的患者中与正常条件下的患者相比没有显著差异。然而，吸烟患者的SNHG15表达显著更高（P < 0.05）。
LINC00963和SNHG15与年龄的相关性
相关性分析显示，LINC00963表达与CAD患者的年龄呈负相关（r = 0.322，p = 0.03），但在对照组中没有相关性。同样，SNHG15表达在CAD患者（r = 0.684，p < 0.0001）和对照组（r = 0.827，p < 0.0001）中与年龄呈负相关。
ROC曲线分析
ROC曲线分析用于确定LINC00963和SNHG15表达作为生物标志物的敏感性和特异性。LINC00963在CAD患者中的曲线下面积（AUC）为0.94（p < 0.0001）。SNHG15的AUC为0.81（p < 0.0001）。
讨论
总体而言，我们的计算机模拟分析突出了322个蛋白编码基因和25个lncRNA在CAD中的显著差异。功能富集分析结果显示，免疫系统和炎症过程的组分、转录调节因子以及受体-配体相互作用是CAD中识别的DEGs最重要的生物学角色。lncRNA-mRNA网络揭示了8个与DEGs相关的lncRNA（LINC00963、PVT1、GABPB1-AS1、MIR34AHG、MIR4435-2HG、ZNF667-AS1、ST20-AS1和SNHG15）。
我们的体外研究证实了CAD患者中LINC00963和SNHG15的上调。此外，还发现有家族病史、高血脂、高血压和糖尿病的患者中，LINC00963表达显著更高。同时，吸烟患者的SNHG15表达显著更高。LINC00963和SNHG15表达与个体年龄呈显著负相关。
动脉粥样硬化是一种慢性炎症状态，其中免疫系统在其启动和发展中起着至关重要的作用。这种炎症导致内皮功能障碍，增加其对脂蛋白的渗透性，导致其在内皮层下积累。此外，这一过程促进白细胞的招募和血小板的激活。迁移到受影响区域的单核细胞分化为巨噬细胞，可以根据微环境呈现促炎或抗炎特性。这些巨噬细胞类型的动态影响动脉瘤的进展或消退。
巨噬细胞和平滑肌细胞都产生炎性细胞因子，如IL-1β、IL-12和IL-6。在动脉壁内，低密度脂蛋白（LDL）胆固醇会经历氧化，而富含甘油三酯和残余脂蛋白进一步驱动炎症。巨噬细胞积极分解这些氧化脂蛋白，形成富含脂质的坏死核心，被胶原纤维帽包裹，最终导致纤维动脉瘤的发展。在慢性炎症背景下，巨噬细胞可能会降解纤维帽，形成薄帽纤维动脉瘤，增加了斑块破裂的风险。
长链间基因非编码RNA 00963（LINC00963）位于人类9q34.11染色体上。其异常表达以前已被证明通过影响各种细胞过程（如增殖、迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT）和凋亡）与癌症进展相关。LINC00963水平升高与不同癌症的临床病理特征和更差的患者预后相关，表明其作为肝细胞癌诊断的潜在生物标志物的可能性。LINC00963可以通过与14种癌症类型中的22种不同miRNA相互作用创建一个复杂的竞争性内源RNA（ceRNA）网络。它还直接影响四个蛋白编码基因。具体来说，LINC00963通过参与EGFR的反式激活，促进前列腺癌从雄激素依赖状态转变为雄激素独立状态。此外，LINC00963与EZH2相互作用，减少p21表达，从而促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭。在非小细胞肺癌中，LINC00963将NONO和CRTC结合在一起，生成一个正反馈环（LINC00963/NONO/CRTC/CREB/LINC00963），增强癌细胞转移。
另一方面，lncRNA SNHG15因其在多种人类癌症发生和进展中的失调而成为显著参与者。SNHG15在多种癌症中经常过表达，包括肺癌、胃癌、结直肠癌和肝癌，其水平与疾病严重程度和不良预后相关。这种lncRNA影响关键过程，如细胞增殖、凋亡、转移和对癌症治疗的营养逃避。SNHG15通过涉及microRNA海绵化的分子机制调节各种致癌基因和抑癌基因。
基于LINC00963和SNHG15在各种与炎症相关的癌症中的作用，以及本研究的结果，可以推断这些lncRNA与炎症状况密切相关。ROC曲线分析表明，LINC00963和SNHG15作为生物标志物具有高敏感性和特异性。此外，当前研究建议这两条lncRNA可作为年轻个体中CAD早期检测的有前途的标志物。涉及更大人群和深入研究这些lncRNA功能的进一步研究将有助于我们更好地理解它们的作用。
尽管我们的研究成功地识别和验证了LINC00963和SNHG15作为CAD的潜在生物标志物，但我们承认缺乏功能性验证实验。未来的研究需要通过敲低或过表达模型来调查它们在血管细胞（如内皮细胞或平滑肌细胞）中的机械作用，以评估其对炎症、迁移和增殖的影响。
结论
研究表明，LINC00963和SNHG15基因表达在CAD患者中显著上调。推测这些lncRNA与CAD中的炎症状况有关。此外，建议LINC00963和SNHG15可作为年轻个体中CAD早期检测的有前途的标志物。虽然我们的研究结果突出显示了LINC00963和SNHG15作为CAD有前途的诊断生物标志物，但进一步的功能研究对于阐明它们在CAD病理生理学中的精确作用是必要的。
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