最近发表在《自然生物技术》杂志上的一项研究表明，研究人员开发了一种新型系统，用于定向进化具有增强转导和生产能力的工程病毒样颗粒（eVLPs）。
什么是eVLPs？
高效且安全地将大分子递送到细胞中体外和体内对于各种新兴治疗模式至关重要。尽管腺相关病毒（AAV）载体可以成功地在体内递送基因编辑剂，但它们存在若干限制。因此，需要额外的递送方法来克服这些限制。病毒样颗粒（VLPs）由病毒支架组成，可以包装和递送货物信使核糖核酸（mRNAs）、蛋白质或核糖核蛋白（RNPs）。VLPs提供高效的转导、组织趋向性、减少脱靶编辑和瞬时货物表达。
此前，本研究的作者开发了eVLPs，能够在体外和体内高效进行基因编辑和蛋白质递送。在这些系统中，货物蛋白与eVLPs中的逆转录病毒Gag蛋白融合，这会引导货物定位到正在形成的病毒颗粒中。货物-Gag连接器包含一个序列，该序列在颗粒形成后被逆转录病毒蛋白酶切割，从而释放颗粒内的货物并进入转导的细胞。
研究发现
研究人员开发了一种定向实验室进化系统用于eVLPs。最初，通过使用条形码单导向RNA（sgRNAs）来确定eVLP变体的身份，以便选择具有特定属性的所需变体。随后，开发了条形码sgRNAs与功能eVLP生产的兼容性，然后将15个碱基对的条形码序列插入sgRNA支架的四环中。
第四代（v4）碱基编辑器（BE）-eVLPs，包装了活性腺嘌呤BE（ABE）核糖核蛋白（RNPs）货物，用于验证实验。标准v4 BE-eVLPs通过共转染四个质粒到生产细胞中产生，这些质粒编码Gag-ABE融合蛋白、莫洛尼小鼠白血病病毒（MMLV）Gag-Pro-Pol多聚蛋白、水疱性口炎病毒G包膜蛋白和指导靶向碱基编辑的sgRNA。
之后，生产并比较了含有四环或经典条形码sgRNAs及四个任意选定条形码的v4 eVLPs，通过测量其碱基编辑效率。条形码eVLPs显示出与标准eVLPs相当的效力，而具有不同条形码sgRNAs的eVLPs也表现出相当的效力。此外，缺乏Gag-ABE融合蛋白的eVLPs比经典v4 eVLPs少包装216倍的sgRNAs。
进一步的实验表明，条形码sgRNAs可用于标记不同的eVLP变体，而经过选择后富集的条形码可识别具有增强适应性的变体。该进化系统随后用于突变和选择具有改进特征的衣壳。为此，生成了一个包含3,762个MMLV Gag蛋白衣壳和核衣壳域单残基突变的条形码eVLP衣壳库。
该条形码库用于构建条形码eVLP生产细胞库。通过慢病毒感染生产细胞，随后扩增转导细胞，放大了具有单一条形码-衣壳变体对的生产细胞比例。条形码eVLP衣壳库经历了两次选择，分别是为了从生产细胞中提高生产和转导HEK293T细胞。为此，从条形码生产细胞库启动eVLP生产，所得衣壳变体库被纯化。
之后，分离出eVLP包装的sgRNAs，并对生产选择后的条形码进行测序。估计了每个条形码序列的eVLP生产富集度，识别出富集度高于经典eVLP衣壳的条形码。大约8%的衣壳突变体在库中的生产富集度高于经典eVLP衣壳。
将纯化的条形码eVLP衣壳库与HEK293T细胞孵育。六小时后，分离出转导到目标细胞中的sgRNAs，并计算每个条形码序列的eVLP转导富集度。只有0.7%的衣壳突变体的平均转导富集度高于经典v4 eVLP衣壳。虽然大多数衣壳突变体的转导和生产效率低于经典v4 eVLP衣壳，但没有突变体在生产和转导方面表现出改善，这表明不同的竞争机制决定了它们的效率。
基于正向生产或转导选择富集，选择了几个突变体进行进一步分析。优先选择那些在一个方面有所改进而不会影响另一个方面的突变体。将衣壳突变引入Gag-ABE结构中并未增加效力。这促使研究人员评估了在Gag-Pro-Pol结构中（GagQ226P-Pro-Pol）最稳健地富集的Q226P突变的衣壳突变体在Gag-ABE结构中的效力。
各种衣壳突变体的BE递送效力比v4 eVLPs提高了高达三倍。五个突变体，包括C507V、C507F、A505W、D502Q和R501I，具有最高的效力；然而，一种突变组合，GagC507V-ABE与GagQ226P-Pro-Pol，效力提高了3.7倍，并被指定为第五代（v5）BE-eVLPs。比较了v4和v5 BE-eVLPs的效力，结果表明v5 BE-eVLPs的碱基编辑效率显著更高，效力更强。有趣的是，使用v4 BE-eVLPs达到的最大编辑效率可以通过16倍较低剂量的v5 BE-eVLPs实现。
结论
本研究的研究人员开发了一种定向进化系统，用于具有所需属性的eVLPs，并利用该系统突变/选择具有增强属性的eVLP衣壳突变体。此外，开发了第五代（v5）eVLPs，其货物包装和释放、颗粒大小和递送效力均优于第四代（v4）eVLPs。总体而言，这种条形码eVLP进化方法可以支持未来递送载体的开发，以克服当前基因编辑系统的局限性。
期刊参考：Raguram, A., An, M., Chen, P. Z., & Liu, D. R. (2024). Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies. Nature Biotechnology. doi:10.1038/s41587-024-02467-x
(全文结束)
