全息生物体范式最终认识到，像所有其他自然生态系统一样，宏生物体的发展和健康受到其所宿主的多样微生物群落的影响。然而，对于微生物群落组装及其环境相互作用的机制洞察仍然很少见。尽管目前预测不到1%的细菌可以在实验室中培养，但过去二十年来，元组学（尤其是宏基因组学）一直是微生物学中最流行的方法。这些方法促进了大量高影响力的发现，同时也引发了许多担忧。
例如：各种女性（和婴儿）健康问题，如免疫学、生育能力和癌症风险，都与不同的阴道“微生物特征”有关，但这关联是如何产生的？我们能否确定阴道菌群失调会导致子宫内膜异位症，还是它们都是由其他因素引起的，如避孕或营养？从那里，我们是否有能力修改微生物群以可持续地恢复健康？
微生物单细胞技术的发展预计会增加知识，因为它将：
- 实现微生物单细胞组学，使群体和亚群体特征化以及群落组装洞察成为可能；
- 加快新微生物生理学的发现，提高培养库通量并打破可培养性障碍。
本文将讨论这两个方面。
单独观察微生物个体以了解微生物群落：矛盾吗？
学习单个细胞似乎有助于我们理解群落和生态系统如何运作。然而，单细胞微生物组学将在微生物生态学和微生物学中做出重大贡献，因为（i）它提供了种群和亚种群多样性及进化模式的访问；（ii）它解决了一些元组学的主要缺点；（iii）它为同一对象提供了互补的视角；（iv）它允许更精细和准确的生理网络视图。
应用于微生物的单细胞组学也面临显著障碍，具体如下：
个体、种群、群落和环境微生物相互作用范围从捕食到共生，包括竞争和互惠（图1）。这些是复杂且相互关联的生态尺度。元组学方法在微生物生态学中从群落到环境规模不等。然而，它们缺乏捕捉生态梯度中小尺度（如种群和亚种群规模）分辨率的能力。
微生物（亚）种群，如物种和较低分类等级，是一个未被充分研究的基因型和表型多样性库，访问内部种群水平可以进行细粒度的进化过程分析、基因获得/丢失过程、种群出现，最终实现群落组装。
当正确使用，特别是在采样方法和样本量方面，单细胞组学涵盖了从个体到群落的整个生态连续体，在同一样本中提供连接所有级别的信息的可能性。
元组学生成的是来自环境中可用分子信息的平均信息。从元组学数据中得出种群级别的见解仍然具有挑战性。在基因组重建（宏基因组组装基因组或MAGs）期间，将来自不同个体基因组和游离DNA的片段组合可能会产生嵌合体（图2）。
当微生物群落极其多样化且密切相关的分类群具有高度相似的基因组时，MAG准确性变得困难。此外，宏基因组学无法区分活细胞中的DNA和游离DNA，后者可以在环境中长时间存在，或死细胞中的DNA。因此，元组学数据无法直接将检测到的基因与其原始微生物细胞甚至其他基因联系起来。
单细胞组学在微生物学中迅速崛起，通过彻底改变视角解决了这一问题。它集中于同一细胞内的DNA、RNA或蛋白质，为研究代谢途径或基因网络提供了新的机会。
最近的研究表明，使用宏基因组学和单细胞全基因组测序（scWGS）观察微生物群落提供了同一样本中多样化的多样性表示。这意味着最全面的方法可能是同时在同一样本上使用元组学和单细胞组学，结合两者的优点：（i）通过宏基因组学高效评估α/β多样性；（ii）通过scWGS进行详细而准确的分析。
单细胞组学在研究微生物生理学方面也可能是一个强大的工具，因为它允许访问单个细胞水平上的基因组装和路径网络。它可以有效地提供用于推断代谢偏好的数据，然后用于选择最佳富集条件，从而成功培养并推动微生物暗物质边界的拓展。
将“微生物暗物质”带入光明：培养不可培养的微生物
微生物暗物质是指由于对生长条件缺乏了解或控制而无法培养的微生物比例。众所周知，超过99%的微生物（特别是细菌和古菌）无法在实验室中培养，尤其是在土壤等较少研究的环境中。
分子研究表明，通过其遗传元素揭示的广泛存在的分类群几乎没有培养代表，包括一些常见且活跃的分类群，如土壤中的酸杆菌门。因此，微生物生理学研究严重集中在一小部分已知微生物上，基于培养的方法发现外推至自然群落是危险的，甚至是不可能的。
如果我们能减少微生物暗物质的数量呢？让我们重新开始并重写本节的第一句话。微生物暗物质是指我们现在无法培养的细菌比例。
Cellenion建议，（i）提高培养生产通量是“微生物亮物质”的关键；（ii）自动化的单微生物细胞分离将解锁它。
传统上，最常见的培养生成方式是：
- 直接平板法（图3A）涉及连续稀释微生物悬浮液并在琼脂培养基上铺板。初次培养后，收集菌落（手动或使用菌落挑取器）并置于液体培养基中。第二次培养后，通常将液体培养物划线到琼脂平板上以确保分离菌株的纯度。第三次培养后，选择划线菌落并置于液体培养基中。第四次培养后，培养物可以保存和/或用于下游分析。
- 稀释至灭绝法（图3B）涉及连续稀释微生物悬浮液并注入液体培养基（通常在微孔板中）。此方法基于泊松定律，即一个孔将被单个细胞接种。初次培养后，选择含有高比例孔的平板，这些孔统计上与单细胞接种相容，每个生长的孔至少划线三次以纯化。第二次培养后，收集划线菌落并置于液体培养基中。第四次培养后，培养物可以保存和/或用于下游分析。
这些方法有严重限制，限制了培养结果。首先，比读取协议定义要繁琐得多。创建培养集合也非常繁琐和耗时：它占据了所有的空间、消耗品和时间。这限制了通量和深度。相反，已证明多种生长条件（营养可用性、培养温度、氧化还原条件及其组合）对分离不同库至关重要。
混合菌落可能由来自不同微生物种群、物种、属或界的细胞共存形成。单克隆性（起始于单一克隆的培养）通过直接平板法或稀释至灭绝法，即使重复划线过程，也难以实现。
第三，某些生物（如某些古菌物种）可能无法在琼脂培养基上生长，使得划线不可能。
单细胞分离自动化与cellenONE可以帮助缓解所有这些限制：
- cellenONE在不影响微生物发育的情况下，将微生物细胞分离到各种消耗品中，包括液体和固体。
- 所有分离细胞的显微镜图像可用于在仪器屏幕上检查单克隆性，消除了划线需求并显著减少了实验时间（图3C）。
- 可以使用形态特征将细胞从混合富集或菌落的微生物悬浮液中分离出来。
- 自动化设备允许高效的一对多和多对一接种，实现高通量单克隆接种。
总体而言，使精确单微生物细胞技术成为可能的技术创新为微生物学的所有分支带来了重大机遇。这反映了从卫星视角到宏观镜头的转变，将为微生物群组装和功能提供机制洞察。
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