摘要
特发性肺纤维化(IPF)是一种与年龄相关的、进行性的、致命的间质性肺疾病，目前有效的治疗方法仍然有限。肺泡II型(AT2)上皮细胞作为兼性干细胞对肺泡修复至关重要；然而，AT2细胞衰老会破坏上皮再生并促进IPF中的纤维化重塑。Syndecan-1是一种跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，主要在肺上皮细胞中表达，但其在纤维化过程中AT2功能障碍中的作用尚未明确定义。在此，我们证明Syndecan-1在IPF和其他纤维化肺疾病以及小鼠博来霉素诱导的肺纤维化中的AT2细胞中显著上调。Syndecan-1表达随年龄增长而增强，并与老年小鼠中增加的纤维化负担相关。通过整合人类转录组分析、小鼠遗传模型和上皮细胞系统，我们表明过量的Syndecan-1促进细胞自主上皮衰老并损害AT2祖细胞功能。升高的Syndecan-1降低了AT2更新能力，破坏了分化，并减少了表面活性蛋白C水平，而Syndecan-1的基因缺失减轻了衰老并保护了损伤后的上皮功能。综上所述，这些发现确定Syndecan-1是肺纤维化中AT2衰老和适应不良修复的关键上皮调节因子，并支持靶向Syndecan-1驱动的上皮功能障碍作为潜在的治疗策略。
引言
慢性呼吸系统疾病，包括间质性肺疾病，是全球发病率和死亡率的重要原因。特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性、致命性疾病，全球发病率不断上升且尚无治愈疗法。除肺移植外，目前尚无能有效阻止或逆转该疾病特征性纤维增生重塑的治疗方法。因此，确定导致纤维化起始和进展的关键分子驱动因素对于开发有针对性且有效的干预措施至关重要。
肺泡II型(AT2)上皮细胞作为肺祖细胞干细胞，通过增殖和分化为肺泡I型(AT1)细胞来维持肺泡稳态并在损伤后进行有效修复。当AT2功能受损时，会导致异常肺泡修复，进而驱动肺纤维化的起始和进展。现有实验和有力证据表明，细胞衰老是AT2功能障碍和耗竭的核心驱动因素，直接导致异常修复和肺纤维化。虽然已经描述了多种促进AT2衰老的分子，但调控这一过程的上游分子相对较少。
Syndecan-1是一种I型跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，表达在气道和肺泡上皮细胞的基底外侧表面，通过其硫酸乙酰肝素链与可溶性或基质相关配体的相互作用来调节多种细胞过程。在正常上皮修复过程中，Syndecan-1的脱落缓解了这种调控约束，从而促进上皮分化和再上皮化。Syndecan-1在AT2细胞中上调并通过抑制靶向细胞衰老通路的miRNAs表现出促纤维化活性。此外，Syndecan-1在流感感染期间减轻上皮细胞凋亡，这一特征与衰老细胞的抗凋亡表型一致。这些发现表明，AT2细胞中过量的Syndecan-1以细胞自主方式促进AT2衰老，导致肺纤维化中异常的肺泡修复。
在本研究中，我们通过互补的人类肺组织和小鼠模型，确定Syndecan-1是AT2细胞衰老的调节因子。我们发现AT2细胞中过量的Syndecan-1表达促进AT2衰老并损害其修复能力。这些缺陷与纤维化肺损伤中异常的肺泡修复相关。机制上，我们发现Syndecan-1介导的AT2衰老与p53乙酰化增加相关。我们的研究确立了上皮Syndecan-1过量表达是AT2细胞衰老的关键决定因素，导致肺泡修复缺陷和纤维化肺重塑。
结果
Syndecan-1在特发性肺纤维化和其他纤维化肺疾病中的肺泡II型细胞中上调
我们先前报道Syndecan-1在包括IPF在内的间质性肺疾病(ILDs)的肺上皮细胞中上调。在本研究中，我们特别关注肺泡II型(AT2)细胞。两项独立分析——一项使用已发表的IPF和对照肺单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集(GSE122960)，另一项使用包含80个对照和85个IPF肺scRNA-seq样本的未发表整合数据集——均显示IPF与对照相比，AT2细胞中Syndecan-1(SDC1)mRNA表达显著增加。与这些发现一致，空间转录组分析(对照N=3，IPF N=2)显示SDC1的上调及其与AT2细胞经典标志物ABCA3的共表达。免疫荧光分析证实IPF肺组织中AT2细胞的SDC1蛋白丰度显著高于对照。值得注意的是，Syndecan-1表达也在其他纤维化ILDs(包括类风湿关节炎相关ILD)中上调，支持Syndecan-1在更广泛的纤维化肺疾病中的作用。这些发现确立了Syndecan-1作为纤维化AT2细胞的保守分子特征。
Syndecan-1在衰老AT2细胞中上调并在老年小鼠中促进肺纤维化
为了确定Syndecan-1在纤维化肺损伤中的年龄依赖性调控，我们分析了年轻和老年小鼠未损伤和博来霉素损伤肺中AT2细胞的Sdc1 mRNA表达。在Day 30博来霉素损伤的AT2细胞中观察到特定的年龄依赖性Sdc1表达增加，而在未损伤AT2细胞中未检测到差异。与这些转录组发现一致，博来霉素给药21天后，年轻和老年小鼠的AT2细胞中Syndecan-1蛋白水平均增加，而在未损伤条件下未观察到年龄依赖性差异。值得注意的是，整个肺切片的图像量化显示，在老年、Day 21、博来霉素损伤的AT2细胞中Syndecan-1表达最高，但与匹配的年轻小鼠相比，这种增加未达到统计学显著性。
为了确定Syndecan-1在AT2细胞中过量表达在体内的功能后果，我们使用博来霉素诱导的肺损伤和纤维化模型来评估纤维化负担。与年龄匹配的Sdc1-/-小鼠相比，老年博来霉素损伤的野生型(WT)小鼠表现出显著更高的每肺胶原沉积，通过羟脯氨酸肺含量测量得到证实，这一结果通过H&E和Pico Sirius染色得到支持。这些数据表明，升高的Syndecan-1表达加剧了老年肺的纤维化重塑。鉴于衰老与细胞衰老之间已建立的关系，以及我们先前发现Syndecan-1通过参与衰老相关通路加剧年轻小鼠的肺纤维化，我们接下来测试了Syndecan-1直接促进AT2细胞衰老的假设，从而驱动肺纤维化中的异常修复和纤维化进展。
Syndecan-1在AT2细胞中上调与AT2衰老相关
鉴于衰老与细胞衰老之间已建立的关系，以及我们先前发现Syndecan-1通过参与衰老相关通路加剧肺纤维化，我们接下来测试了Syndecan-1直接促进AT2细胞衰老的假设。为了进一步定义Syndecan-1与AT2细胞衰老之间的关系，我们首先评估了复合转录组衰老评分(SenMayo衰老评分)在IPF和对照肺中AT2细胞中的情况。IPF AT2细胞表现出显著高于对照AT2细胞的SenMayo衰老评分，这一发现在空间转录组数据集中得到独立验证。根据Syndecan-1表达水平将AT2细胞分层——高(SDC1Hi)与低(SDC1Low)——显示SDC1表达与衰老评分呈正相关。为了在蛋白水平验证这些转录组发现，我们对对照和IPF肺移植标本进行免疫染色，检测衰老标志物p21，并量化SDC1+ AT2细胞群中p21+细胞的比例。IPF肺组织显示出比对照显著更高的p21+SDC1+双阳性细胞百分比，支持升高的Syndecan-1表达与人类纤维化肺中AT2细胞衰老之间的联系。
Syndecan-1介导肺上皮细胞衰老
为了直接证明Syndecan-1在AT2细胞衰老中的直接作用，我们从分选的SftpcCreER.R26-tdTomato+细胞生成AT2肺泡球体，并在博来霉素暴露后评估衰老。博来霉素刺激48小时后，WT AT2肺泡球体表现出比Sdc1-/-肺泡球体显著更高比例的p16+细胞。类似地，在阿霉素诱导的衰老中也观察到p16和p21表达的降低。
为了进一步定义Syndecan-1在促进肺上皮细胞衰老中的作用，我们使用小鼠和人类肺上皮细胞模型。首先在未受干扰的MLE-15细胞中，过表达Syndecan-1(在未刺激细胞中)增加了p16和p21表达，高于对照。相比之下，MLE-15-KO细胞在基础水平和博来霉素刺激后均表现出降低的p21表达。此外，血清饥饿MLE-15细胞48小时增加了SA-β-半乳糖苷酶活性，OE细胞最高，随后是WT和KO细胞。这些数据表明Syndecan-1的改变与细胞衰老呈正相关。一致地，在人类肺上皮细胞系(BEAS-2B和A549细胞)中沉默或敲低SDC1导致p21表达降低和SA-β-半乳糖苷酶活性减弱。在SDC1沉默的BEAS-2B细胞中恢复Syndecan-1表达逆转了这些效应。总之，这些数据表明Syndecan-1表达以细胞自主方式直接且正向调控上皮细胞衰老。
过量的Syndecan-1损害AT2细胞更新和分化
接下来，我们使用AT2肺泡球体实验检查过量Syndecan-1对AT2细胞功能能力的影响。在未损伤条件下，WT和Sdc1-/- AT2肺泡球体的集落形成效率(CFE)相当。博来霉素损伤显著降低了两种基因型的CFE；然而，与Sdc1-/-肺泡球体相比，WT的降低更为显著。AT2分化评估显示，未损伤WT和Sdc1-/-培养物具有正常的肺泡球体形态。相比之下，博来霉素损伤的WT AT2肺泡球体表现出异常形态和AT1标志物(Pdpn)定位紊乱，提示分化受损。这些异常在博来霉素损伤的Sdc1-/-肺泡球体中得到缓解。总之，这些发现表明升高的Syndecan-1水平损害AT2更新并破坏损伤后的正常分化。
过量的Syndecan-1损害肺组织中AT2细胞功能
鉴于AT2细胞合成和分泌表面活性蛋白C(SP-C)，这是维持肺泡稳定性的关键调节因子，且SP-C功能障碍与纤维化肺疾病相关，我们接下来使用精密切割肺切片(PCLS)在肺微环境中评估AT2细胞功能。从年轻Day 14博来霉素损伤的WT和Sdc1-/- Sftpc谱系追踪小鼠中生成PCLS，并在Incucyte S3活细胞成像系统中培养7天。代表AT2细胞丰度的tdTomato(红色)荧光强度在博来霉素损伤的Sdc1-/- PCLS中显著高于匹配的WT PCLS，而代表间质或纤维化成分的绿色自发荧光在Sdc1-/-组织中也降低。与保留的AT2功能一致，通过ELISA在Day 3 PCLS培养基中测量的SP-C水平在Sdc1-/-切片中显著高于WT切片。这些数据进一步支持过量Syndecan-1损害损伤后AT2细胞功能的结论。
Syndecan-1诱导p53乙酰化
为了识别Syndecan-1下游的衰老信号通路，我们使用Ingenuity通路分析(IPA)对IPF与对照肺中AT2差异表达基因进行上游调节因子分析。TP53成为IPF AT2细胞中最显著激活的转录调节因子(z-score = 2.27; adjusted P = 2.6 × 10⁻⁶²)。构建SDC1和TP53为中心的互作网络揭示了连接这两条通路的多个共享节点，包括CDC42和TGFB1等调节因子，暗示Syndecan-1–TP53串扰在衰老调控中的作用。
我们接下来使用未发表的整合scRNA-seq队列评估人类AT2细胞中的转录组p53活性评分。根据Syndecan-1表达分层的AT2细胞显示IPF与对照细胞相比p53活性评分显著升高，SDC1Hi AT2细胞在两组中均表现出升高的p53活性。与这些发现一致，博来霉素损伤的小鼠AT2细胞表现出增加的p53活性，在老年小鼠中评分最高。根据Syndecan-1表达的分层重现了人类模式。WT和Sdc1-/- AT2细胞的比较显示，在Sdc1缺陷细胞中p53活性有减弱的趋势，特别是在老年队列中，而年轻AT2细胞显示出最小的基因型依赖性差异。鉴于先前报道p53乙酰化在p21诱导中的作用，我们检查了WT和Sdc1-/- MLE-15细胞在博来霉素刺激后p53在赖氨酸379(K379)位点的乙酰化。p53K379乙酰化在WT细胞中强烈诱导，但在Sdc1-/-细胞中显著降低，总p53丰度没有差异。此外，降低的p53乙酰化与p21下调相关。这些发现表明Syndecan-1通过调节p53激活促进上皮衰老。
总之，这些发现表明Syndecan-1通过可能的p53依赖性信号传导促进上皮衰老，损害AT2更新、分化和分泌功能，从而驱动肺疾病中的异常修复和纤维化重塑。
讨论
肺泡II型(AT2)上皮细胞是肺损伤后肺泡修复的核心，而AT2祖细胞功能受损是肺纤维化的定义特征。在本研究中，我们确定过量Syndecan-1是AT2细胞自主衰老的上皮调节因子，促进异常修复和纤维化重塑。通过整合人类转录组分析、小鼠遗传模型和体外上皮系统，我们发现Syndecan-1与AT2细胞中p53信号激活相关，对更新能力产生下游影响。
衰老的AT2细胞在IPF和实验性纤维化中积累，并与疾病进展密切相关。在此背景下，Syndecan-1在人类纤维化肺疾病和小鼠博来霉素损伤中的纤维化AT2细胞中持续上调。功能上，过量Syndecan-1增强衰老并破坏关键AT2特性。这些观察结果与最近的空间转录组学研究一致，这些研究确定了持续处于过渡、非解决状态的Syndecan-1富集上皮群体。我们解释这些数据表明，Syndecan-1相关的衰老将AT2细胞限制在这些功能失调的程序中，从而维持异常修复。相比之下，Syndecan-1缺失减轻衰老，保留AT2干性特征，并改善上皮功能，支持其因果作用。观察到的Syndecan-1过量导致表面活性蛋白C减少——无论反映AT2细胞丢失还是生产受损——仍有待阐明。Syndecan-1也可能作为促衰老配体(包括胰岛素样生长因子(IGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员)的共受体，尽管这需要直接实验评估。
在机制上，我们的数据将Syndecan-1置于p53/p21轴的上游。Syndecan-1缺失降低p53乙酰化而不影响总p53水平，表明在p53激活水平而非丰度上进行调控。这一效应的机制仍有待定义。鉴于Syndecan-1的细胞表面定位，与核乙酰化机制的直接相互作用不太可能。相反，Syndecan-1可能调节汇聚到p53的上游信号通路。从先前工作和我们的互作网络中出现的候选物包括KLF6，以及生长因子依赖性信号通路。Syndecan-1结合TGF-β、EGF和VEGF，并可以激活下游级联反应，如JunD和ERK/MAPK，已知这些级联与p53信号传导相交。在此背景下，Syndecan-1可能作为信号节点，放大细胞外应激线索，增强p53乙酰化，并在上皮细胞中强化衰老程序。
Syndecan-1在衰老中的作用可能是背景依赖的，先前研究报道了其在成纤维细胞中的不同效应。我们的发现支持过量完整Syndecan-1在纤维化肺疾病上皮中的促衰老作用。鉴于AT2衰老对纤维化发病机制的核心贡献，调节Syndecan-1可能代表恢复上皮修复能力的策略。使用AT2特异性遗传方法和离体人肺模型的未来研究将有助于确定靶向Syndecan-1是否在治疗上可行。
【全文结束】