引言
肥胖是一个重大的公共卫生挑战，增加了代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的风险。MASLD的特征是肝脏中脂质的长期积累，与2型糖尿病和心血管疾病密切相关，给医疗系统带来重大负担。虽然热量限制能有效改善肝脂肪变性和代谢健康，但其长期依从性仍然具有挑战性。
限时进食（TRE）作为一种有前景的饮食方法已经出现，它将食物摄入限制在≤10小时的预定义进食窗口内，随后是≥14小时的禁食期。值得注意的是，我们团队和其他人已经证明，TRE耐受性良好，能达到高依从率，导致最小的不良影响，从而在超重或肥胖个体中实现适度的体重减轻和轻微的心脏代谢健康改善。进食窗口的时间安排如何影响TRE对肝脏脂肪分数和肝脏健康标志物的效果仍不确定。
少数研究调查了TRE对肝脏脂肪分数的影响，使用磁共振成像（MRI）或MRI结合磁共振波谱，这两种都是测量肝脏脂肪分数的已确立、非侵入性金标准方法。总体而言，这些研究表明TRE可以减少肝脏脂肪分数，同时改善肝功能，但由于缺乏对照组、干预持续时间短或仅关注早期TRE方案等局限性，无法得出明确结论。我们最近报告称，在12周干预后，早期TRE（进食窗口约为09:45至17:30）、晚期TRE（约14:20至21:30）和自选TRE（约12:20至20:00）结合常规护理（UC，约08:30至22:00）——一种基于地中海饮食的教育计划——显著减少了通过MRI测量的内脏脂肪组织；然而，这些减少与UC单独相比没有差异。但是，早期TRE与UC和其他TRE方案相比，显著降低了空腹和夜间葡萄糖水平，并且与UC相比减少了皮下腹部脂肪组织。肝脏表现出强烈的昼夜节律，调节参与葡萄糖和脂质代谢的酶的表达和活性，在人类中早晨达到峰值。因此，早期TRE可能对肝脏脂肪分数和肝脏健康标志物产生更大的影响在生物学上是合理的。
此外，肠道-肝脏轴功能障碍已被确定为MASLD的一个促成因素，肠道微生物群组成和功能的负面变化导致脂质吸收增加，并通过失调的肝细胞因子和细胞因子分泌引发促炎级联反应，从而加剧肝脏炎症。因此，了解TRE、肠道微生物群组成和肝脏脂肪分数之间的潜在相互作用可能为MASLD提供新的治疗方法。
在这项随机对照试验（RCT）中，我们研究了三种不同的TRE方案——一天早期部分的8小时进食窗口（早期TRE）、一天较晚部分的8小时窗口（晚期TRE）和参与者自选的进食窗口（自选TRE），结合UC，与单独UC相比，在12周内对超重或肥胖男女的MRI测量的肝脏脂肪分数、定量弹性成像肝脏标志物（包括硬度、衰减和粘度）、肝脏酶、循环肝相关脂肪因子和肝细胞因子以及粪便微生物群组成的影响。
材料和方法
研究设计
本研究是一项多中心、平行组、研究者发起的随机对照试验的二次分析。该试验获得了西班牙相关监管机构和伦理委员会的批准，包括安达卢西亚卫生服务（Servicio Andaluz de Salud）、格拉纳达省研究伦理委员会（Comité Ético de Investigación Provincial de Granada）（参考号：1/22）和纳瓦拉临床研究伦理委员会（Comité Ético de Investigación Clínica de Navarra）（PI_2021/119）。该研究在ClinicalTrials.gov（标识符：NCT05310721）注册，并按照随机临床试验的报告统一标准（CONSORT）指南进行。所有参与者在入组前均提供了书面知情同意书。
参与者和资格标准
纳入标准包括30至60岁西班牙白种男女，BMI在25.0至40.0 kg/m²之间，具有腹部肥胖（男性腰围≥95 cm，女性≥82 cm），体重稳定（±3%）≥3个月，每周中等到剧烈体力活动<150分钟，习惯性进食窗口≥12小时，以及至少一种与代谢综合征相关的心血管代谢危险因素。
关键排除标准包括正在进行减肥计划、存在心血管或慢性疾病（如近期心肌梗死、出血性卒中、库欣综合征、肾上腺皮质功能不全或1型或2型糖尿病）、妊娠或哺乳，以及目前上夜班。
研究招募、入组和随机化
参与者在2022年4月11日至2022年12月5日期间在九个连续波次中入组，每个中心10-13人，最终研究程序于2023年3月6日完成。基线评估后，参与者使用分层、置换区块设计被随机分配到四个干预组之一。随机化按研究地点和性别分层，区块大小可变（4和8）。在每个区块内，参与者按1:1:1:1的比例被随机平均分配到四个研究组之一。
负责获取和分析MRI衍生的肝脏脂肪分数、基于超声的结果以及分析空腹血液样本和粪便微生物群组成的人员对组分配设盲。相比之下，负责提供干预和进行其他评估的工作人员未设盲（开放式设计）。
研究评估和结局
肝脏脂肪分数
在基线和12周干预后进行评估。在禁食条件（至少4-5小时）下使用MRI（Siemens 3T Magnetom Vida, Siemens Healthineers, Erlangen, Germany）测量肝脏脂肪分数。肝脂肪变性阶段定义如下：S0：无脂肪变性（肝脏脂肪分数<5%）；S1：轻度脂肪变性（肝脏脂肪分数≥5%且<15%）；S2：中度脂肪变性（肝脏脂肪分数≥15%且<25%）；S3：重度脂肪变性（肝脏脂肪分数≥25%）。肝脏脂肪分数≥5.0%且超重或肥胖的参与者根据当前临床实践指南被归类为患有MASLD。MASLD缓解定义为基线时肝脏脂肪分数≥5.0%，12周干预后<5.0%。
脂肪因子、肝细胞因子和脂肪-肝细胞因子
使用商业酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（R&D Systems, MN, USA）测量脂肪因子、肝细胞因子和脂肪-肝细胞因子，遵循制造商的规格说明。
粪便微生物群
共有182名参与者在干预前和干预最后两周内提供粪便样本，用于通过16S rRNA扩增子测序进行粪便微生物群分析。由于测序技术问题和低质量数据，最终分析包括138名参与者在干预两个时间点的肠道微生物群数据。
研究干预和对照条件
UC组参与者保持其习惯性进食时间表（≥12小时进食窗口），并接受健康生活方式教育计划，基于地中海饮食模式，并符合世界卫生组织的身体活动建议。
早期TRE组参与者选择一个不超过10:00开始的8小时进食窗口，而晚期TRE组选择一个不早于13:00开始的8小时窗口。自选TRE组在干预开始前确定其首选的8小时进食窗口。所有TRE参与者被指示在整个12周干预期间保持相同的进食窗口，并每天（即每周七天）坚持。
鉴于西班牙以晚餐时间较晚著称——通常在22:00左右，而意大利为21:00，法国为20:00，德国为19:00，瑞典为18:00，我们允许早期TRE参与者选择一个不晚于10:00开始的8小时窗口，使晚餐时间最晚可达18:00。虽然这在其他国家可能被认为是典型的晚餐时间，但在西班牙标准下仍然较早。
统计分析
样本量和功效计算基于原始研究的主要结局（内脏脂肪组织变化），如前所述。由于本工作仅关注次要结局，因此未对这些分析进行单独的先验样本量或功效估计。
使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性。在分析前对数据进行筛选以发现潜在的异常值和数据录入错误，但没有排除任何观察结果，因为没有发现生理上不可信的值或技术错误。由于分布偏斜，脂肪因子、肝细胞因子和脂肪-肝细胞因子经过log10转换以使分布正常化进行统计分析；然而，结果以原始单位呈现以方便解释。
使用重复测量线性混合效应模型评估12周干预对次要结局（即肝脏参数、脂肪因子、肝细胞因子、脂肪-肝细胞因子、饮食摄入和粪便微生物群的α多样性指标）的影响。根据干预组、时间和组×时间交互作用对个体结局的变化进行建模，将参与者ID作为随机截距以考虑参与者内重复测量。所有模型中均包含性别作为协变量。
使用R（v.4.4.2; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）进行所有统计分析。所有分析的双侧P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
基线参与者特征
共有197名参与者（98名女性）被纳入本研究。表1显示了按组划分的研究参与者基线描述数据。
肝脏脂肪分数、肝脏硬度、衰减、粘度和肝脏酶
在早期TRE组（平均变化：-1.2%；95%置信区间[CI]，-2.2至-0.2；P=0.02）、晚期TRE组（平均变化：-2.3%；95% CI，-3.3至-1.3；P<0.001）和自选TRE组（平均变化：-1.5%；95% CI，-2.6至-0.5；P<0.001）中观察到肝脏脂肪分数显著降低，但在UC组中未观察到（平均变化：-0.8%；95% CI，-1.8至0.2；P=0.12）。
然而，在早期TRE（平均差异：-0.4%；95%置信区间[CI]，-2.3至1.5；P=0.95）、晚期TRE（平均差异：-1.5%；95% CI，-3.3至0.3；P=0.15）和自选TRE组（平均差异：-0.7%；95% CI，-2.6至1.2；P=0.77）与UC组相比，未检测到肝脏脂肪分数变化的统计学显著差异。在TRE组之间也未观察到显著差异。男性MASLD患病率高于女性（n=88 vs. n=66；P<0.001）。12周时MASLD缓解的参与者百分比在各组间相似（UC：4.7%[n=2]；早期TRE：15.6%[n=5]；晚期TRE：6.8%[n=3]；自选TRE：20.0%[n=7]；P=0.11）。
值得注意的是，在探索性分析中，当TRE组参与者根据基线MASLD状态（肝脏脂肪分数≥5.0%）进行分类时，我们观察到MASLD参与者与无该疾病的参与者相比，肝脏脂肪分数减少更为显著（平均差异：-2.7%；95% CI，-4.1至-1.2；P<0.001）。
脂肪因子、肝细胞因子、脂肪-肝细胞因子以及与肝脏脂肪分数变化的相关性
在任何TRE组与UC组相比（所有P≥0.13），或TRE组之间（所有P≥0.24），在脂肪因子、肝细胞因子和脂肪-肝细胞因子变化方面均未观察到统计学显著差异。
肝脏脂肪分数随时间的变化与几种肝细胞因子的减少显著相关（即ANGPTL3、β-Klotho、clusterin和follistatin）（所有r≥0.263，所有P=0.001），以及与选定的脂肪-肝细胞因子的减少相关，特别是DPPIV和RBP4（两者r≥0.307，两者P<0.001）。
粪便微生物群组成
干预前后粪便微生物群的α和β多样性指数显示在表S3和图S3A-D中。在基线粪便微生物群组成（P=0.29）、β（P=0.30）和α（所有P≥0.42）多样性指数方面，各组之间均未观察到统计学显著差异。在组间α和β多样性指数变化方面也未观察到统计学显著差异（所有P≥0.16）。
临床上有意义的体重减轻与所有研究结局变化的关联
实现临床上有意义的体重减轻（≥5%；所谓应答者）的参与者比例在各组间显著不同（UC=16%，早期TRE=41%，晚期TRE=44%，自选TRE=43%；P=0.001）。具体来说，实现至少5%体重减轻的参与者表现出更大的肝脏脂肪分数减少（平均差异：-2.6%；95% CI，-3.5至-1.6；P<0.001）和ALT减少（平均差异：-9 mg/dL；95% CI，-13至-5；P<0.001），但在肝脏硬度、ATI或其他肝脏酶水平变化方面未观察到其他显著差异（所有P≥0.21）。
12周时MASLD缓解的参与者百分比在两组中相似（<5%体重减轻：7.5%[n=7]；≥5%体重减轻：18.9%[n=10]；P=0.09）。此外，体重减轻≥5%的参与者在脂肪因子omentin（平均差异：-9.8 ng/mL；95% CI，-17.8至-1.7；P=0.046）和肝细胞因子ANGPTL3（平均差异：-48.8 ng/mL；95% CI，-96.1至-1.5；P=0.046）以及clusterin（平均差异：-32.5 μg/mL；95% CI，-55.4至-9.6；P=0.02）方面有统计学显著减少。
讨论
这项RCT的二次分析表明，将TRE（无论进食窗口时间安排如何）添加到基于地中海饮食的营养教育计划（UC）中12周，与单独UC相比，对减少超重或肥胖成年人的肝脏脂肪分数、改善肝脏健康标志物或调节粪便微生物群组成没有额外益处。值得注意的是，基线时患有MASLD的TRE组参与者比无该疾病的参与者表现出更大的肝脏脂肪分数减少，这可能表明TRE对已有肝脂肪变性的个体可能更有效，与最近的研究一致。
在探索性分析中，我们观察到实现临床上显著体重减轻（≥5%）的参与者（其中91%来自TRE组）与未达到这些条件的参与者相比，肝脏脂肪分数减少更大，同时ALT、脂肪因子omentin以及肝细胞因子ANGPTL3和clusterin得到改善。这些发现提出了一个可能性，即肝脏脂肪分数和肝脏健康标志物的改善可能与体重减轻的程度关系更密切，而非进食窗口的时间安排。
我们的结果与先前显示TRE可以改善肝脏脂肪相关结局的试验一致，但这些效果似乎不会根据进食窗口时间安排而有显著差异。先前比较早期与晚期TRE、TRE加热量限制与单独热量限制，或不同TRE方案结合低热量饮食的研究通常报告各组间肝脏脂肪、脂肪变性或肝脏健康标志物的相似改善。这一模式与我们发现的TRE组内肝脏脂肪分数减少，但在TRE方案之间或与UC相比没有显著差异一致。
这些发现表明，观察到的肝脏相关改善更可能是由能量不足（可能由缩短的进食窗口引起）解释的，而非食物摄入的具体时间安排。然而，我们观察到早期和自选TRE组的MASLD缓解率略高于UC和晚期TRE组，尽管这些差异未达到统计学显著性。
一个特别值得注意的发现是，基线时患有MASLD的TRE组参与者比无该疾病的参与者经历了显著更大的肝脏脂肪分数减少（-2.1% vs. +0.5%）。这表明基线肝脏脂肪较高的个体可能从TRE中获得更大的肝脏益处，可能是由于有更大的改善空间。
更高比例的TRE组参与者实现了临床上有意义的体重减轻（≥5%），而实现≥5%体重减轻与更大的肝脏脂肪分数减少相关（-3.1% vs. -0.5%）。这些发现表明，体重减轻程度可能是肝脏脂肪减少和相关生物标志物变化的关键驱动因素。
关于TRE代谢益处的一个拟议机制是调节肠道微生物群。然而，目前的证据仍然不一致。在我们的研究中，与UC相比，TRE并未显著改变粪便微生物群组成、α多样性或β多样性，肝脏脂肪分数的变化与微生物群变化无关。这些发现表明，我们试验中观察到的肝脏效应不太可能主要由肠道微生物群变化介导。
本研究有几个局限性。它是二次分析，因此样本量的功率计算不是基于肝脏脂肪分数、其他与健康相关的肝脏健康标志物或粪便微生物群组成，而是基于内脏脂肪组织变化，这是该研究的主要结局。还应注意的是，参与者在基线时肝脏脂肪分数、肝脏硬度、肝脏酶和心血管代谢危险因素正常或仅轻度升高，这可能减少了与纳入MASLD或更先进代谢疾病参与者的试验相比检测到更大效果的潜力。此外，12周的干预期可能不足以观察到干预组之间的显著差异。
结论
在这项实施三种不同TRE方案的RCT的二次分析中，研究结果表明，将TRE添加到基于地中海饮食的营养计划中，并不会比仅进行饮食教育在减少超重或肥胖男女的肝脏脂肪分数、改善肝脏健康标志物或粪便微生物群组成方面带来额外益处。
我们的探索性分析表明，TRE是管理MASLD早期阶段的高度有前景和针对性的策略，因为它证明了在已有肝脂肪变性的个体中显著降低肝脏脂肪分数的能力。值得注意的是，实现临床上有意义的体重减轻（≥5%）的参与者（其中91%属于TRE组）与未实现者相比，表现出更大的肝脏脂肪分数减少，以及ALT、omentin、ANGPTL3和clusterin水平的改善。这些初步发现表明，肝脏相关改善可能与体重减轻程度关系更密切，而非进食窗口时间安排，TRE可能通过促进体重减轻来贡献。
需要进一步充分功效的试验来证实我们的结果，并确定进食窗口的时间安排（特别是早期与晚期TRE）是否对肝脏脂肪分数、肝脏健康标志物和潜在机制产生差异影响，重点关注肠道-肝脏轴。此外，需要在MASLD、肝硬化和患有慢性疾病的患者人群中进行更多研究，其中昼夜因素可能发挥关键作用。
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