硒悖论：从进化氧化还原化学到药物化学
1. 引言：硒与好氧生命的进化
在考虑地球生命的进化时，关注点通常放在大规模事件上，包括大气中氧气的出现、多细胞生物的发展以及生命从海洋向陆地的过渡。很少有人考虑微量元素对进化过程的潜在影响。然而，可以认为硒可能是生物复杂性出现过程中一位未被颂扬的主角。
最近的地球化学证据表明，硒不仅是一种使高级生命形式适应好氧条件的生化工具，还可以被视为一个敏感的指标，为研究地球进化史上最重大时期之一——大氧化事件（GOE，约24-21亿年前）提供有用信息。保存在古代海洋沉积物中的硒同位素表明，在此期间地表氧水平显著增加，而海洋深处仍基本处于缺氧状态。正如沉积物中硒的同位素分布所示，随后在Shunga-Francevillian碳同位素异常期间，环境中的氧水平随后降至非常低的水平。据推测，这些氧化还原电位的波动可能对真核生物的进化进程产生了深远影响，因为真核生物拥有一些严格需氧的代谢过程。
同样，硒同位素研究也被用作追踪新元古代（10-5.42亿年前）地球氧化还原条件的工具，揭示了海洋氧化和大气氧含量的增加持续了至少1亿年，从而为第一批动物的进化铺平了道路。最近，研究人员通过将人工智能应用于大型地球化学数据库和复杂的气候模型，分析了氧敏感金属、有机碳和原始海洋健康之间的关系。结果表明，与传统预期相反，在新元古代晚期，深海并未突然完全氧化。相反，大气氧含量和海洋生物生产力在极长时间内逐渐持续增加。因此，大气氧的上升重塑了代谢进化的进程。分子钟数据显示，呼吸途径在这一大气变化后的数亿年中在各种生态系统中多样化并扩散。
Vadim Gladyshev及其同事报告的数据支持这样一种进化情景：许多硒蛋白家族在真核生物早期进化过程中出现，随后受到特定栖息地选择压力的塑造。水生环境已被证明有助于硒依赖氧化还原系统的保留和多样化。相比之下，陆地适应伴随着硒蛋白组的收缩或丧失。总体而言，这些观察表明环境可用性以及/或与陆地生命相关的生态约束在限制硒的利用中发挥了关键作用，尽管潜在机制仍有待阐明。
这种观点代表了对硒的一般看法的范式转变。硒不应再被视为仅具有抗氧化特性的微量营养素，而应被视为一种氧化还原调节剂，作为行星氧化还原化学和生物进化之间的分子桥梁。硒的地球化学行为使古代氧化还原转变得以重建。同样，它在生物系统中的生物整合可能为生物体提供了在含氧量日益丰富的环境中生存所需的生化灵活性。或者，可用氧的量可能决定了作为微量营养素被整合到生命物种蛋白库中的硒的量。
大气氧的增加带来了机遇和危险。氧气的存在已被证明可以促进更有效的能量生产，通过有氧代谢过程。然而，需要注意的是，这个过程也会产生活性氧物质（ROS），已被证明能够对蛋白质、脂质和DNA造成损害。这就导致了一个矛盾的情况，即生物体必须首先在含氧环境中存活，然后才能将其用于代谢过程。在此精确时刻，硒与其它抗ROS防御机制一起在进化过程中扮演了关键角色。
2. 为什么进化选择了硒
整合到生物系统中的硒原子数量远低于硫原子；估计约为每10,000-100,000个硫原子对应一个硒原子。这一观察表明，硒可能在生物体的化学中主要发挥催化作用。
与化学相关的硫相比，硒表现出更大的极化性，这一特性使其在还原条件下具有更高的亲核性，在氧化条件下具有更高的亲电性。这导致了更高的反应性和更低的pKa，这些特性使含硒分子在氧化还原反应中特别有效。在生物系统中，硒被整合到硒半胱氨酸中，通常被称为"第21种氨基酸"，产生专门用于抗氧化防御和代谢调节的硒蛋白。
与半胱氨酸不同，硒半胱氨酸不是蛋白质原氨基酸，细胞中不存在游离硒半胱氨酸池，且推测由于其不稳定性和形成相应二硒键的明显倾向，假定的硒半胱氨酰-tRNA合成酶从未进化。因此，进化选择了高度保守的转录后整合机制。在整个进化过程中维持这种复杂机制的显著持久性特别值得注意。将硒半胱氨酸整合到蛋白质中需要重新解释UGA终止密码子、存在SECIS元素（硒半胱氨酸插入序列）、专用tRNA和专用延伸因子。进化理论通常表明，生物系统趋向于简单性和能量效率。因此，维持如此复杂的机制强烈表明硒提供了显著的适应优势。最近已就此主题发表了一篇优秀的综述文章。
少数硒蛋白有助于保护细胞免受氧化应激，是整体抗氧化防御系统的一部分。最著名的例子是谷胱甘肽过氧化物酶，它们中和过氧化氢和脂质过氧化物。类似地，硫氧还蛋白还原酶在维持细胞内氧化还原平衡中发挥作用。从这个角度看，硒不应仅仅被视为辅助微量营养素，而应被视为一种选择性进化因素。向好氧生命的转变不仅由氧气可用性决定，还由管理氧化损伤的生化能力决定。含硒酶因此可能代表了一种关键创新，使生物体首先能够耐受，随后利用富氧环境。
3. 硒悖论
还必须考虑硒的双重性质。在生理浓度下，硒表现为保护性和调节性剂；然而，在较高浓度下，它变得有毒且具有促氧化作用。使硒在抗氧化酶中高度有效的相同化学特性也解释了当它未被正确整合到蛋白质结构和能够稳定并维持其还原形式的生物系统中时的毒性。过量的硒已被证明会产生活性氧，干扰DNA稳定性，并引起氧化损伤，特别是由于自由基。因此，生命已经进化出利用硒的机制，以及严格调控它的系统。这种微妙的平衡可能为不同物种之间观察到的硒利用变化提供了一个理由。研究表明，当暴露在富含硒的环境（其中各种无机形式的硒在水中高度可溶）中时，海洋生物通常拥有广泛的硒蛋白组。相比之下，许多陆地生物已被观察到显示出硒依赖蛋白的减少甚至丧失。向陆地生活的过渡需要适应不太可预测且通常更稀缺的硒供应。为了确保生存，陆地生物进化了一种过程，将硒半胱氨酸的UGA终止密码子序列转换为标准半胱氨酸密码子。显然，进化并未普遍最大化硒的使用；相反，生物体根据这种元素的生态可用性和代谢需要进行了适应。
4. 从进化氧化还原化学到药物化学
当分析硒作为生物系统中氧化还原调节剂的作用，能够响应甚至可能驱动进化压力时，很明显设计含硒药物需要仔细考虑。到目前为止，硒在抗氧化防御系统中的生物参与导致了对其作为抗氧化剂的治疗潜力的广泛推测。
几十年来，研究人员专注于合成和研究显示明显抗氧化活性的小分子有机硒化合物。在1973年Rotruck和Flohè将GPx鉴定为第一个硒酶后，研究人员调查了几类作为谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）模拟物的硒衍生物。GPx与过氧还蛋白和过氧化氢酶一起代表了负责消除细胞中活性氧的主要酶类。它催化有害过氧化物（如过氧化氢和脂质过氧化物）还原为毒性较小的衍生物，同时将两个还原型谷胱甘肽（GSH）分子氧化为谷胱甘肽二硫化物（GSSG）（图1a）。
这些研究对阐明硒在硒酶中的催化作用以及不同类别的硒化合物——包括二硒化物、硒化物和苯并硒唑酮——如何在过氧化氢和含硫辅因子（如GSH、二硫苏糖醇（DTTred）和硫酚（PhSH））存在下反应做出了重大贡献。在此类条件下，大多数硒衍生物促进过氧化物还原，同时伴随着硫醇氧化。硫醇氧化速率的直接或间接测量通常被称为GPx样活性（图1b）。
然而，尽管大量出版物声称硒化合物具有抗氧化特性，体外GPx模拟物的具体治疗应用仍未实现。迄今为止，尚无含硒的上市药物。此外，Ebselen作为一种最有希望的有机硒化合物，其药物潜力已被广泛探索，但反复未能满足期望。
5. 为什么GPx模拟物经常失败（硒的亲核面）
人类GPx酶中的硒原子参与涉及邻近氨基酸（如Sec、Gln和Trp）的催化三元组，这些氨基酸稳定了不寻常的硒醇氧化态（-SeH）。此外，硒醇基团的pKa约为5.2，使其在生理pH下主要以去质子化的硒醇盐形式（-Se−）存在。在此形式下（图1，I），硒表现出强亲核性，并可被过氧化物轻易氧化，生成相应的硒酸（II）。在催化循环中，此中间体随后通过两个GSH分子氧化还原为活性硒醇盐形式。
催化三元组还在防止硒过度氧化为硒酸、过硒酸或硒酸方面发挥关键作用，这些物质更难还原回催化活性状态。此外，酶环境内的非键合相互作用通过调节中间体III中硒和硫原子的亲电性来促进催化剂再生。在此中间体中，硫原子必须比硒更具亲电性，以利于第二个GSH分子的亲核攻击。这允许硒醇盐再生，同时避免在硒上发生不产生结果的硫醇交换，这将中断催化循环。
显然，这种精细平衡的弱相互作用网络负责在整个催化循环中精确调节硒氧化还原特性。这样的条件极难在小型合成有机分子中重现。例如，据报道，GPx1表现出的kcat/KM（×10³ M⁻¹ s⁻¹）为854.2，远高于Ebselen（3.6）、二苯基二硒化物（2.0）和PhSeZnCl（0.4）。
这种限制仍然是设计高效GPx样抗氧化剂的主要挑战之一，并且由于硒化合物不针对单一受体，而是针对能够触发不可预测生物级联的复杂氧化还原平衡网络，这一挑战进一步复杂化。
6. 面向靶向氧化还原药理学：方法学和概念局限性（硒的亲电面）
硒亲电性的增加降低了其还原特性，同时增加了其对游离硫醇或硫醇盐的亲核攻击的敏感性，导致形成共价硫族-硫族键（图2）。
2012年，Lee等人引入了"硒悖论"一词来描述硒在生物系统中的双峰作用，即缺乏和过量都与严重副作用相关，这是由于最佳摄入范围极其狭窄。
许多有机硒化合物的非特异性亲电性和促氧化活性在很大程度上导致了它们的细胞毒性。这些分子经常与许多可氧化的细胞靶点反应，特别是游离半胱氨酸残基和锌指结构域。相反，将氧化选择性地导向特定可氧化靶点的可能性可能代表有机硒化合物药物应用的更有希望的策略。
2015年，我们证明HIV逆转录病毒核衣壳蛋白7（NCp7）的锌指结构域是系列2,2'-二硒双苯甲酰胺（DISeBAs）（化合物2，图3）的优先靶点。抑制此蛋白导致广泛的抗HIV活性，EC50值在低微摩尔范围内，并在急性感染和持续感染细胞中表现出显著的选择性指数，包括对多药耐药HIV-1毒株和临床分离株的活性。同样，Ebselen（图3，结构1；R = Ph，R' = H）被证明是新德里金属-β-内酰胺酶（NDM-1）的有效共价抑制剂。
与针对NCp7的DISeBAs类似，Ebselen与NDM-1中的锌指结构域相互作用。串联质谱研究表明，在活性位点内形成了涉及半胱氨酸221的共价Se-S键。
对于SARS-CoV-2病毒的Mpro蛋白也观察到了类似的抑制效果，由各种Ebselen衍生物及其相应的二硒化物诱导。然而，研究表明，所有有机硒化合物，特别是更具亲电性的化合物（如Ebselen），对酶表现出强烈的抑制活性。这种活性在感染细胞中并不总是能够复制。可以合理地假设，无论是Ebselen还是二硒化物都不能完整地到达靶半胱氨酸。特别是对于Ebselen，已经证明其与谷胱甘肽具有高反应性，可以合理地假设有机硒化合物在生物环境中的第一个化学事件正是其与谷胱甘肽的反应。迄今为止，研究界对此方面关注甚少。然而，本文作者坚信，对生物系统中硒-硫键形成和反应性的深入研究对于理解涉及有机硒化合物的硫醇交换平衡网络至关重要。只有通过这种严格的研究，我们才能希望确定这些化合物的命运，以及它们的生物活性和产生这种活性的机制。
这些观察表明，硒化学未来的治疗潜力不在于开发通用抗氧化剂，而在于选择性靶向对氧化还原反应敏感的高度反应性蛋白质结构域。然而，要实现这一目标，有必要进一步研究每个有机硒化合物进入生物系统时决定其命运的氧化还原化学机制。在此背景下，硒不应再被视为简单的抗氧化支架，而应被视为一种经过数十亿年进化选择的、化学可调节的氧化还原活性药效团。这些研究也可能为Ebselen迄今为止为何在任何临床试验中都未能成功提供见解，尽管其在所有酶学测试中具有低毒性和高活性。在共价酶抑制的背景下，必须认识到系统的动态性质，其中与催化必需半胱氨酸的Se-S键易受谷胱甘肽或其他游离硫醇的还原和解毒。据推测，ebselen可能缺乏能够稳定这种键从而防止其还原（和快速解毒）的分子支架。本文作者认为，如果将催化半胱氨酸视为靶受体，则可以采用接近经典药物化学的分子设计方法。
7. 是否没有抗氧化活性的潜力？
关于硒如何被进化选为生命系统抗氧化防御中的关键元素以及如何被整合到生物系统中的叙述提供了有价值的见解。
(1) 硒优于硫的原因在于其能够采用-1氧化态，该氧化态在生理pH下赋予其强吸电子特性，从而增加其对过氧化物的反应性。
(2) 这种氧化态难以在未被分子内相互作用（即蛋白质结构外）稳定的结构中再现。
(3) 硒醇与过氧化物的反应产生一种亲电性和促氧化物质，该物质由于细胞内谷胱甘肽和谷胱甘肽还原酶的过量存在而发挥其抗氧化作用，谷胱甘肽还原酶维持细胞内的还原电位。
有机硒化合物的亲核形式极不稳定；因此，可以合理用作生物活性分子的化合物要么是温和的亲电体，如二硒化物，要么是更强的亲电体，如Ebselen。这些元素将与复杂的氧化还原平衡网络相互作用，产生难以预测的整体效果。据推测，开发具有抗氧化活性的小分子有机硒化合物需要一种整体方法，将生物氧化还原视为一个复杂系统，其中化合物引起扰动，使所有平衡发生偏移，产生整体效果，而不仅仅是各个效果的简单总和。只有通过转变我们的范式，从还原论转向整体视角，我们才能真正设想开发作为氧化还原调节剂的化合物的可能性。这些调节剂将支持细胞防御氧化应激及其造成的损害。
非常近期的研究表明，整合组学技术和人工智能的整体方法有可能促进新型个性化抗氧化疗法的开发，从而为临床转化和针对特定疾病的干预开辟新途径。
除了针对亲核半胱氨酸的传统共价药物外，越来越明显的是，半胱氨酸氧化还原组可以被视为具有有趣治疗潜力的动态调控水平。
8. 结论
硒在生物学中的历史表明，其作用远比简单抗氧化元素复杂得多。进化选择了硒，因为其特殊的氧化还原特性，但同时通过复杂的生化机制约束和严格调控其使用。这种进化平衡突显了药物化学的一个重要教训：硒活性不能与其运作的生物环境分离。
在这篇评论文章中，我们提出，致力于GPx模拟物和基于硒的抗氧化剂的大量研究可能受到概念性偏差的影响。该领域经常假设用小型合成有机硒化合物复制GPx的催化循环就足以获得有效的抗氧化药物。然而，数十年的研究表明，在简化的体外系统中观察到的抗氧化活性很少能在体内转化为治疗效果。到目前为止，尚无有机硒化合物作为抗氧化药物上市，即使是Ebselen，尽管在众多实验模型中取得高度有希望的结果，但在临床试验中始终未能达到预期。
这些观察结果不应必然被解释为硒化学缺乏药物潜力的证据。相反，它们表明有机硒化合物的生物活性可能由比简单过氧化物还原更复杂的机制控制。硒的固有亲电性、其与谷胱甘肽和细胞硫醇的快速相互作用，以及其扰动相互关联的氧化还原平衡的能力，使这些化合物成为整体氧化还原调节剂，而不是直接的GPx替代品。
因此，我们认为未来的研究应该超越仅集中于GPx样活性测定的传统还原论方法。对硒-硫交换反应、硫醇反应性和氧化还原敏感蛋白质结构域的选择性靶向的更深入理解，可能为治疗应用提供更现实的途径。在此背景下，有机硒化合物不应仅被视为抗氧化模拟物，而应被视为受进化启发的氧化还原活性药效团，其活性源于与生物系统的复杂相互作用。
只有通过拥抱这种更广泛、更整体的视角，才能确定硒化学是否真正能够产生临床上有用的分子，并最终弥合引人入胜的实验室结果与真正的治疗创新之间的差距。
作者贡献：M.P.、C.G.和C.S.负责撰写—审阅和编辑。所有作者均已阅读并同意发表版本的手稿。
资金支持：本研究未获得外部资金支持。
机构审查委员会声明：不适用。
知情同意声明：不适用。
数据可用性声明：本研究未创建或分析新数据。数据共享不适用于本文。
致谢：本手稿是在硒硫氧化还原和催化剂网络SeSRedCat的框架下撰写的。
利益冲突声明：作者声明无利益冲突。
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