“鼠尾草提取物偶联磁铁矿和硒纳米复合材料对多重耐药病原菌表现出增强的抗菌和抗生物膜活性”
摘要
多重耐药病原菌和生物膜相关感染的日益流行凸显了对替代抗菌策略的迫切需求。在本研究中，多重耐药性测试显示，革兰氏阳性菌（Staphylococcus pasteuri、Listeria monocytogenes 和 Bacillus cereus；69–77%）的耐药性低于革兰氏阴性菌株（Proteus mirabilis、Pseudomonas aeruginosa 和 Escherichia coli；83–92%）。利用L-抗坏血酸通过绿色化学还原法合成了磁铁矿纳米颗粒和硒纳米颗粒，随后将其与鼠尾草水提物偶联以增强稳定性和生物活性。TEM、DLS、XRD和FT-IR分析证实了合成的金属纳米颗粒的纳米级晶体结构，以及鼠尾草植物化学成分成功整合到纳米复合材料中。植物化学表征进一步揭示了鼠尾草生物活性化合物在两种纳米复合材料中的不同附着和保留程度。SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的MIC值（0.03–1 和 0.03–0.5 µg/mL）不仅显著低于SaO提取物（125–500 µg/mL）和MNPs（0.5–25 µg/mL），而且与美罗培南（0.25–2 µg/mL）相当甚至超过。TEM验证了强烈的抗菌活性，显示出细胞外和细胞内变形，与生长曲线抑制模式一致。纳米复合材料还表现出强大的抗生物膜活性，SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs分别实现了32.5–59.5%和30.2–56.7%的抑制，超过了美罗培南的最大抑制值（32.5–47.6%）。
引言
多重耐药菌是全球最重大的关注点，因为它们对多种常规抗生素类别表现出耐药性，并且在全球范围内频繁分离出来。这明确表明了创新抗菌方法的必要性，例如植物提取物、天然或修饰蛋白以及纳米颗粒，这些可以单独使用或与已知抗生素联合使用。抗菌药物耐药性是多耐药表型发展的基础，主要源于抗生素的误用和过度使用，如长期或过量给药以及未进行适当诊断的用药，从而对人类健康构成严重威胁。常规抗生素通常靶向特定的细胞位点；然而，长期暴露会引起这些靶点的改变，导致药物摄取减少或进入细胞失败。此外，细菌突变可能导致细胞壁或膜的结构修饰、外排系统的激活以及抗生素的酶促失活，包括β-内酰胺酶的产生。因此，开发具有替代性和非特异性作用模式的创新抗菌剂已成为当务之急。
纳米技术已成为开发先进抗菌剂的关键领域。各种纳米材料的合成因其在成像、诊断和靶向药物递送系统中的潜在应用而备受关注，这些系统可提高治疗效果。在氧化铁纳米材料中，磁铁矿是一种具有反尖晶石结构的磁性氧化铁，因其在八面体位点Fe²⁺和Fe³⁺离子之间的电子转移而具有独特的电学和磁学性质。由于Fe₃O₄NPs具有生物相容性、低细胞毒性、超顺磁性和高稳定性，在药物递送、热疗、组织工程和磁共振成像应用中显示出前景。环境友好的铁纳米颗粒合成路线进一步推进了其生物医学相关性。
硒同时具有促氧化和抗氧化特性，使其成为人体中必需的微量元素。然而，大量的硒可能具有毒性和健康危害。生物过程依赖于硒，它也是抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶的必需元素，可保护身体免受自由基物种的侵害。硒纳米颗粒已知是人类和动物健康必需的微量元素。它们对于免疫系统正常功能和防止疾病传播是必要的。由于其显著的生物活性、低毒性和高生物利用度，硒纳米颗粒在近年来的合成和分析中吸引了更多关注。
药用植物通过其多样的生物活性化合物在许多人类疾病的治疗中发挥了重要作用，这些化合物通常从植物的各个部分提取，包括叶、果、茎和根，并因其广泛的药理特性而广受认可，如抗寄生虫、抗菌、抗氧化、抗高血压、杀虫、抗癌、抗病毒、抗真菌和降血糖活性。S. officinalis L. 是唇形科的一种芳香草本植物，被认为是最重要的药用植物之一，因其多样的药理活性，并作为调味和芳香剂用于烹饪制品，以及广泛应用于化妆品和传统医学。为了最大化其治疗功效并促进实际应用，先进制剂技术的发展变得越来越重要。在这些策略中，植物提取物与纳米颗粒的偶联已被广泛研究，以改善生物稳定性、最小化毒性、延长生物活性并显著增强其治疗潜力。
生物膜相关感染由于其对常规抗生素和宿主免疫反应的高度耐药性，在临床微生物学中构成了重大挑战。生物膜的结构复杂性，包括细胞外聚合物物质，限制了药物渗透并促进了慢性感染。近年来，植物提取物-纳米复合材料通过多种机制显示出有前景的抗生物膜潜力，包括产生活性氧、破坏群体感应通路以及抑制细胞外聚合物物质产生。
本研究旨在评估鼠尾草水提物、金属纳米颗粒及其杂交组合对多重耐药革兰氏阳性和阴性菌的抗菌和抗生物膜活性。并将其效果与常规抗生素进行比较，以评估基于纳米颗粒的杂交体作为可持续和高效替代品对抗多重耐药和生物膜相关感染的潜力。
结果
- 革兰氏阳性菌的抗生素敏感性。
测试的革兰氏阳性菌的抗生素敏感性测定结果见表1。美罗培南是唯一能抑制所有三种致病菌株生长的抗生素，反映出最高的抗生素有效率100%。三种抗生素对S. pasteuri有窄谱抗菌作用，AE为33%。九种抗生素完全无效，AE为0%。B. cereus和L. monocytogenes的多重抗生素耐药指数最高，为0.77；S. pasteuri的MAR指数为0.69。
- 革兰氏阴性菌的抗生素敏感性。
如表2所示，美罗培南是唯一对三种革兰氏阴性致病菌株表现出可测量效果的抗生素，AE为66%。其余11种抗生素完全无效。MAR指数显示，E. coli和P. mirabilis的耐药水平最高，MAR值为0.92；*P
P. aeruginosa的MAR指数为0.83，对应于对十种抗生素的耐药性。
- 植物提取物对革兰氏阳性和阴性病原菌的抗菌活性：
研究了SaO的抗菌活性，结果见表S1。在10000 µg/mL浓度下，SaO提取物表现出广谱抗菌效果，对革兰氏阳性和阴性菌的抑菌圈范围为10.00±0.26 mm至15.00±0.17 mm。对S. pasteuri和L. monocytogenes的活性最强，突出了革兰氏阳性菌株的更高敏感性。相比之下，革兰氏阴性菌如P. mirabilis、P. aeruginosa和E. coli的抑菌圈更有限。方差分析证实了测试微生物之间存在显著差异。
- Fe₃O₄NPs、SeNPs、SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的表征。
Fe₃O₄NPs的颗粒直径范围为14.5–21.1 nm，在TEM图像中由于氧化铁的高电子密度而呈现特征性暗对比。Fe₃O₄NPs主要呈球形，表面轮廓光滑。而SaO-Fe₃O₄NPs纳米复合材料的粒径范围为8.7–25.4 nm。对于SeNPs，TEM分析显示单个颗粒直径范围为14.3–17.1 nm。在SaO-SeNPs中观察到表观粒径显著增加，范围为17.25–40.70 nm。动态光散射分析结果显示，Fe₃O₄NPs的粒径为74.3±4.5 nm，SaO-Fe₃O₄NPs为74.3±4.2 nm，SeNPs为69.4±3.2 nm，SaO-SeNPs为69.4±3.8 nm。SaO提取物本身的流体动力学直径为31.5±2.1 nm。所有纳米颗粒样品的多分散性指数值均低于0.3，范围为0.155至0.238。SaO-Fe₃O₄NPs的PDI值最低（0.155）。
Zeta电位测量结果显示，所有合成的纳米材料均带负电荷，ζ电位值范围为-18.7至-35.2 mV。裸纳米颗粒（Fe₃O₄NPs和SeNPs）分别表现出中等负电荷-21.3±1.8 mV和-28.5±2.1 mV。在SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs中观察到表面负电性显著增加，ζ电位分别为-32.8±2.6 mV和-35.2±2.4 mV。电导率测量范围为0.096至0.134 mS/cm，pH值维持在近中性范围（6.8–7.1）。
Fe₃O₄NPs的X射线衍射图谱在2θ=30.1°、35.5°、43.1°、53.5°、57.0°和62.7°处出现强衍射峰，分别对应于磁铁矿立方尖晶石结构的晶面。SaO-Fe₃O₄NPs纳米复合材料保持了特征立方尖晶石衍射图案，峰位相同。SeNPs的XRD图谱在2θ=23.5°、29.7°、41.3°、43.7°、45.4°、51.8°、56.2°和61.7°处出现明显衍射峰。SaO-SeNPs纳米复合材料的XRD图谱保留了特征六方硒衍射峰。
傅里叶变换红外光谱在4000–400 cm⁻¹波数范围内以4 cm⁻¹分辨率采集。Fe₃O₄NPs在3435 cm⁻¹处显示O-H伸缩带，在1630 cm⁻¹处显示H-O-H弯曲振动。尖晶石结构的诊断性Fe-O振动模式出现在585和470 cm⁻¹处的强吸收带。SeNPs在约3420 cm⁻¹处显示宽吸收带，在1635 cm⁻¹处观察到明显峰，在1080 cm⁻¹处检测到吸收，在680 cm⁻¹处还观察到弱带。SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的FT-IR光谱显示出显著丰富的谱图，具有额外的吸收带。两种偶联体系分别在3410–3400 cm⁻¹处显示强吸收，在2930–2925 cm⁻¹处出现脂肪链的C-H伸缩振动，在1705–1700 cm⁻¹处观察到强吸收带，在1615–1610 cm⁻¹处出现芳香C=C环振动，在1385–1380 cm⁻¹处出现C-H弯曲模式，在1240–1235 cm⁻¹处出现C-O伸缩振动。芳香C-H面外弯曲振动在815–810 cm⁻¹处表现为吸收带。重要的是，在SaO-Fe₃O₄NPs中，特征Fe-O振动仍然明显。
- 纳米复合材料中酚类和黄酮类化合物的保留情况。
对于酚类物质，SaO提取物中最初存在的所有六种化合物均在SaO-Fe₃O₄NPs中检测到，浓度略有变化。相比之下，SaO-SeNPs仅保留了四种酚类化合物，浓度低于SaO提取物和SaO-Fe₃O₄NPs，但阿魏酸除外，其值高于两者。对于黄酮类化合物，SaO-FeNPs仅保留了七种组分中的五种，与粗提物相比差异较小。相比之下，SaO-SeNPs完全保留了所有七种黄酮类化合物，但水平低于SaO提取物和SaO-FeNPs，如表5所示。
- Fe₃O₄NPs和SeNPs的抗菌活性。
研究了两种MNPs的抗菌功效，结果见表6。在5至250 µg/mL浓度范围内，Fe₃O₄NPs的抗菌活性因测试菌株而异。在革兰氏阳性菌中，L. monocytogenes的总体敏感性最高，平均抑菌圈最大，其次为B. cereus。相比之下，革兰氏阴性菌对Fe₃O₄NPs的敏感性相对较低。SeNPs也表现出显著的抗菌活性。L. monocytogenes的敏感性最高，P. mirabilis和P. aeruginosa表现出中等敏感性，E. coli的响应最弱。S. pasteuri对两种MNPs的敏感性最高，在较低浓度下，Fe₃O₄NPs表现出非显著更高的活性。
- SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的抗菌活性。
SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs对选定的致病性革兰氏阳性和阴性菌株的抗菌功效见表8。在0.25–50 µg/mL浓度下，两者对L. monocytogenes的抗菌效果最高。SaO-SeNPs对B. cereus和P. mirabilis的抗菌活性高于SaO-Fe₃O₄NPs。P. aeruginosa在SaO-Fe₃O₄NPs处理下的抑菌圈略高但显著。而E. coli受两者影响最小。SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs在极低浓度下对S. pasteuri表现出最强的抗菌效果。
- 制备的生物活性物质的比较分析。
如表10所示，SaO提取物的抗菌活性有限，对S. pasteuri的MIC最低。Fe₃O₄NPs和SeNPs的抗菌活性显著高于SaO提取物。S. pasteuri最敏感，B. cereus、P. aeruginosa和E. coli的敏感性较低。SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs对S. pasteuri的MIC最低，与单独MNPs相比降低了约17倍。总体而言，SaO-SeNPs对革兰氏阳性和阴性菌的性能始终且显著优于SaO-Fe₃O₄NPs。SaO-SeNPs对革兰氏阳性菌的MIC值与参考抗生素美罗培南相当，但对革兰氏阴性菌的MIC值更低，表明对后者的功效更强。
- Fe₃O₄NPs、SeNPs、SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs对致病菌生长抑制的定量评估。
图3和4显示了在2倍MIC下24小时革兰氏阳性和阴性菌的生长曲线。总体而言，与对照相比，细菌生长显著下降，SaO-纳米复合材料表现出最强的抑制作用。对照培养物通常在12-24小时内达到最大OD值。在革兰氏阳性菌中，S. pasteuri的敏感性最高：Fe₃O₄NPs和SeNPs分别抑制了45%和43%的生长，而SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs进一步将抑制率提高到84%和82%。对于革兰氏阴性菌，纳米复合材料也实现了显著更高的生长抑制。
- 敏感细菌细胞的TEM图像分析。
如图5所示，TEM图像揭示了与对照相比，用2倍MIC的测试材料处理的S. pasteuri和P. mirabilis的超微结构改变。对照细胞形态完整。经美罗培南处理的细胞出现内容物聚集和细胞壁不均匀。相比之下，经纳米复合材料处理的S. pasteuri细胞出现严重皱缩和破裂，P. mirabilis细胞出现结构塌陷，包括外膜穿孔和细胞质紊乱。细胞上或细胞内的黑点很可能对应纳米复合材料聚集体。
- SaO、MNPs及其纳米复合材料与美罗培南相比对测试致病菌的定量抗生物膜活性。
如图6所示，在所有测试菌株中，S. pasteuri对SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的敏感性最高，分别实现了最高的抑制程度，超过了单独的MNPs、SaO提取物甚至抗生素美罗培南。L. monocytogenes也表现出强烈的抗生物膜响应。革兰氏阴性菌的生物膜抑制通常低于革兰氏阳性菌。P. mirabilis对抗生物膜处理的响应最强，P. aeruginosa表现出相似水平，E. coli的耐药性最强。
讨论
在本研究中，革兰氏阳性菌对测试抗生素的敏感性高于革兰氏阴性菌。这与它们的结构组成一致，革兰氏阳性菌具有较厚的肽聚糖层但缺乏外膜，有利于许多抗菌药物的渗透和作用。相比之下，革兰氏阴性菌富含脂多糖的外膜充当选择性屏障，限制了几种抗生素的摄取，加上外排泵和酶促失活等额外耐药机制，使其本质上更具耐药性。美罗培南是唯一对革兰氏阳性和阴性菌均表现出广谱功效的抗生素，这与其作为碳青霉烯类抗生素的特性相符。
SaO煎煮提取物增强的生物活性可能源于复杂植物成分的部分热解，提高了其渗透性和生物利用度。在10,000 µg/mL下，SaO提取物表现出中等抗菌活性，对革兰氏阳性菌的效果优于革兰氏阴性菌。
SaO-Fe₃O₄NPs的尺寸略有减小，表明SaO提取物中的有机稳定剂介导了增强的颗粒个体化和防止聚集。SaO-SeNPs中观察到的尺寸增大归因于植物化学成分形成的有机涂层。DLS测量的流体动力学直径始终大于相应的TEM核心尺寸，这是由于水合层、表面吸附的生物分子和双电层的存在。所有纳米颗粒的低PDI值表明相对单分散的胶体系统，而负ζ电位值表明良好的分散行为。与SaO提取物的偶联显著增强了表面电负性，表明优异的静电稳定性。XRD图谱证实了Fe₃O₄NPs和SeNPs的结晶性质，而FT-IR光谱提供了SaO植物化学物质成功吸附到纳米颗粒表面的分子级证据。
植物化学分析显示SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs在酚类和黄酮类化合物保留方面存在差异，这可能部分解释了两者之间抗菌和抗生物膜性能的差异。
MNPs的抗菌作用是由于其纳米级尺寸，但它们的功效在较低浓度下受到限制，特别是在革兰氏阴性菌中。SaO提取物与MNPs的组合可能协同作用，通过多种机制增强抗菌活性。TEM图像显示，暴露于纳米复合材料后，细菌细胞发生了广泛的破坏，远超美罗培南的效果。SaO-SeNPs对细菌细胞的影响大于SaO-Fe₃O₄NPs，这可能归因于硒对含硫醇蛋白质的高反应性。
结论
本研究表明，将SaO提取物与Fe₃O₄NPs和SeNPs偶联可产生具有显著抗菌和抗生物膜功效的SaO-纳米复合材料，有效应对了多重耐药性的紧迫挑战。复合材料的MIC值显著低于SaO提取物和单独的MNPs，并且在某些情况下优于参考抗生素美罗培南。它们的抗生物膜抑制也超过了美罗培南，凸显了其作为下一代抗菌剂的潜力。全面的理化表征证实了纳米复合材料中生物活性植物化学物质的成功合成和保留，而TEM分析验证了细菌细胞的严重结构损伤。总之，这些发现强调了植物化学物质和纳米颗粒之间的协同作用，为对抗多重耐药病原体和生物膜相关感染提供了一种有前景的策略。未来的研究应扩展到体内评估和机制研究，以推进其向临床应用的转化。
材料和方法
- 细菌菌株和培养基。
本研究使用的细菌病原体在-20°C下保存为冷冻储备。测试组包括三种革兰氏阳性菌：L. monocytogenes LMG10470、B. cereus ATCC14579和S. pasteuri，以及三种革兰氏阴性菌：P. mirabilis DSM4479、E. coli LMG8223和P. aeruginosa LMG8029。所有菌株均来自埃及扎加齐格大学理学院植物学与微生物学系培养物保藏中心。
- 抗生素敏感性试验。
按照先前描述的方法进行抗生素敏感性试验。细菌接种物调整为0.5 McFarland标准浊度。将标准化悬浮液接种到Mueller-Hinton琼脂平板上。对于革兰氏阴性菌，测试了12种抗生素；对于革兰氏阳性菌，测试了13种抗生素。抗生素纸片放置在琼脂表面，平板在35°C下孵育24-48小时。测量抑菌圈直径，并根据CLSI指南解释结果。
- 植物材料。
干燥的SaO叶片购自埃及沙基亚省扎加齐格当地市场。植物叶片由扎加齐格大学理学院植物学与微生物学系的Samir Salem博士鉴定。
SaO提取物的制备。
采用煎煮法制备SaO水提物。将10克干燥SaO叶片研磨成细粉，在100 mL蒸馏水中煮沸20分钟，冷却至室温后过滤，滤液收集并在4°C下储存。
- 使用L-抗坏血酸绿色合成MNPs。
Fe₃O₄NPs和SeNPs的合成采用L-抗坏血酸作为还原剂和封端剂。将铁盐或亚硒酸钠分别溶解在去离子水中，加热，滴加L-抗坏血酸溶液，调节pH至碱性，搅拌1小时，最终浓度调整为1000 µg/mL。产物经离心、洗涤并储存于4°C。
- SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的制备。
将绿色合成的MNPs与SaO水提物以1:1重量比混合，超声处理30分钟以增强均质性和稳定性，最终悬浮液储存于4°C。
Fe₃O₄NPs、SeNPs、SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs的表征。
使用TEM、DLS、Zeta电位、XRD和FT-IR进行表征。
- MNPs和SaO-纳米复合材料的高效液相色谱分析。
使用HPLC系统分析酚类和黄酮类化合物。
- SaO提取物、MNPs及其纳米复合材料对测试细菌的抗菌活性筛选。
采用琼脂孔扩散法测定抗菌活性，并通过微量稀释法测定MIC值。
- SaO提取物、Fe₃O₄NPs、SeNPs、SaO-Fe₃O₄NPs和SaO-SeNPs与美罗培南相比的抗生物膜活性评估。
采用微孔板结晶紫染色法评估抗生物膜活性。
统计分析
数据采用方差分析进行分析，平均值比较采用最小显著差异检验。所有统计分析使用GenStat第18版进行。数据以平均值±标准误表示。图表使用Excel 2021构建。
数据可用性
数据将根据要求提供。
缩写
BHI: 脑心浸液；AST: 抗生素敏感性试验；CLSI: 临床和实验室标准协会；MDR: 多重耐药；AE%: 抗生素有效率；SaO: 鼠尾草；MNPs: 金属纳米颗粒；MIC: 最低抑菌浓度；Fe₃O₄NPs: 磁铁矿纳米颗粒；SeNPs: 硒纳米颗粒；HPLC: 高效液相色谱；DLS: 动态光散射；XRD: X射线衍射；FT-IR: 傅里叶变换红外光谱；TEM: 透射电子显微镜。
参考文献
[此处省略82条参考文献，因篇幅限制]
致谢
作者感谢扎加齐格大学。
资助
开放获取资金由埃及科学技术与创新资助局与埃及知识银行合作提供。
作者信息
Gamal Enan, Neveen Abou El-Wafa, Ali Osman 和 Seham Abdel-Shafi: 埃及扎加齐格大学理学院植物学与微生物学系。
Mahmoud M. El-Saber: 埃及开罗沙漠研究中心遗传资源部生物化学室。
Mahmoud Sitohy: 埃及扎加齐格大学农学院生物化学系。
Seham Abdel-Shafi: 伊拉克巴格达Al-Farahidi大学。
贡献
GE: 概念化、资源、写作-审阅与编辑、监督。NA: 实验、写作、分析、审阅、编辑与验证。MM: 验证、分析、调查、制备。AO:根据您的反馈，我将继续完成翻译的剩余部分，并确保以【全文结束】结尾。
概念化、资源、写作-审阅与编辑、监督。NA：实验、写作、分析、审阅、编辑与验证。MM：验证、分析、调查、制备。AO：概念化、方法学与调查。SA：资源、写作-审阅与编辑、监督。MS：概念化、资源、写作-审阅与编辑、监督。
通讯作者
通讯作者为Neveen Abou El-Wafa 和 Seham Abdel-Shafi。
伦理声明
利益冲突：作者声明无利益冲突。
发表同意：所有参与作者均同意发表本文。
伦理批准与参与者同意：本研究不涉及动物或人体实验。
补充信息
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权利与许可
本文采用知识共享署名4.0国际许可协议。如需查看该许可副本，请访问
关于本文
引用本文：Enan, G.等. “鼠尾草提取物偶联磁铁矿和硒纳米复合材料对多重耐药病原菌表现出增强的抗菌和抗生物膜活性”. Sci Rep 16, 9201 (2026).
接收日期：2025年12月10日
接受日期：2026年2月9日
出版日期：2026年3月16日
记录版本日期：2026年3月17日
关键词：鼠尾草、金属纳米颗粒、抗菌活性、纳米复合材料、多重耐药。
【全文结束】
