摘要
全基因组关联研究(GWAS)通常关注单核苷酸多态性(SNPs)，往往忽略了复杂的遗传变异，如短串联重复序列(STRs)。本文报道了对STR系统性评估的结果，这些STR通过全基因组测序直接基因分型或基因型填充方式，分析了来自英国生物银行(Biobank)的约33万名个体(3287例阿尔茨海默病患者；47,048例阿尔茨海默病代理病例；283,111名对照)中阿尔茨海默病风险的作用。利用STR基因型数据，我们识别出15个独立基因座显示出与阿尔茨海默病风险全基因组显著相关的证据。虽然大多数已识别的基因座已在基于SNP的GWAS中被突出显示，但我们检测到靠近SNX32基因(chr. 11q13)和WSB1基因(chr. 17q11)的STR信号。此外，我们描述了几个其他基因座，其中STR(而非SNP)要么代表主要信号(ABCA7)，要么对SNP驱动的关联做出实质性贡献(HLA-DRB1、MINDY/ADAM10和APOE)。遗传度分析估计，STR至少解释了该数据集中阿尔茨海默病总表型方差的3%。将我们确定的顶级STR与人脑样本的DNA甲基化和转录组谱型进行对比，表明几个STR可能通过影响基因表达来发挥其作用。
引言
阿尔茨海默病(AD)是一种遗传复杂的神经退行性疾病。对于早发性家族性AD(EOFAD)，已确定在三个基因(APP、PSEN1、PSEN2)中存在罕见的致病突变，通常导致65岁前发病。然而，绝大多数AD病例具有较晚的疾病发作(通常称为晚发型AD[LOAD])，其遗传结构由多基因风险架构控制。对于后一种形式，全基因组关联研究(GWAS)已发现超过70个基因座的常见变异(通常是单核苷酸多态性[SNPs])显著改变疾病风险。尽管GWAS已显著增强我们对AD遗传学的理解，但已知基因座仍无法解释大部分表型方差，这种情况常被称为"缺失遗传度"。
这部分缺失的遗传度可能由其他类型遗传变异的效应引起，如串联重复(TR)多态性。TR代表基因组的重复元素，由特定核苷酸序列("重复单元")组成，以头对尾的方式("串联")相邻排列。短串联重复序列(STRs)是TR的子类别，其重复单元大小在1-6个碱基对(bp)之间。众所周知，STRs可能通过TR序列的扩增直接导致疾病(例如，STR扩增导致亨廷顿病或脆性X综合征)。通常，这些TR扩增非常罕见，并像单基因致病突变一样发挥作用。然而，大多数STR的长度高度可变，这些长度多态性已与基因表达、mRNA剪接、DNA甲基化以及疾病风险相关联，强调了它们在塑造多样化人类特征中的作用。
尽管其重要性，但由于技术限制，直到最近才对STR效应进行全基因组规模的系统分析。现在，随着成本效益高的全基因组测序(WGS)方法的发展和TR感知计算工具的开发，这一状况已发生改变。这些发展共同促成了WGS衍生的STR参考面板的创建，允许从SNP基因分型数据中填充STR多态性。尽管如此，仍有相对较少的研究在全基因组规模上探究STR在复杂特征中的作用。这些研究要么使用填充的STR，要么使用WGS直接检测的STR。总体而言，目前可用的相关文献表明，5-10%的复杂性状GWAS信号可能由STR而非SNP引起。对于AD，我们只知有一项相关研究。可能由于其相对较小的样本量(n≈3000)，该研究中唯一确定显示显著STR相关效应的基因座是APOE。总之，STR为基础的GWAS对于包括AD在内的复杂性状仍较为罕见。已发表的少数研究得出结论，STR可能对复杂性状的遗传架构做出重要且迄今为止被低估的贡献。
本研究中，我们旨在系统且全面地评估STR多态性对AD风险的潜在作用。总体而言，我们识别出254个填充STR和1个WGS衍生STR在该数据集的14个独立基因座中显示与AD风险的全基因组显著关联。
结果
我们使用填充和WGS衍生STR数据，在英国生物银行(UKB)的333,446名(3287名AD病例；47,048名AD代理病例)和107,289名(1026名AD病例，15,089名AD代理病例)样本中进行STR-based GWAS分析。主要分析中，STR在双等位基因检验中进行分析，然后对在双等位基因检验中达到全基因组显著性的变异进行多等位基因分析。最后，使用UKB队列中的独立子集对全基因组显著关联基因座进行验证分析。最后，将相关的STR基因座进行体内精细定位，以解开SNP与STR的各自作用，并使用基于脑的meQTL和eQTL数据进行初步功能表征。
填充STR的全基因组关联分析
经过质量控制(QC)，我们最终纳入了333,446名不相关英国生物银行参与者(不同祖先；见"方法"部分)，包括3287名临床诊断的AD病例、47,048名AD代理病例和283,111名对照(补充图1和补充表1)。为发现，我们对295,551名自称"白人-英国"的参与者(发现队列：2947名AD病例、42,923名AD代理病例和249,681名对照；补充表1)和3,026,404个通过QC的填充STR变异进行了GWAS分析(见"方法"部分)。这些分析产生了254个变异，位于14个独立基因座，通过了我们经过多重检验校正的全基因组显著性阈值(P<1.49E-07；见"方法"部分)。此外，还有228个变异分布在21个独立基因座，显示出至少全基因组提示性证据(α=1.0E-05)(图1A，补充数据1)。观察到与预期全基因组检验统计量的比较显示λ为1.056，表明我们的STR-based GWAS结果不受过度膨胀的影响(补充图2A)。
在两个GWAS中，诊断和代理AD病例使用结果的线性编码进行组合(见"方法"部分)。每个框中，根据GENCODE V47标注了最近的蛋白质编码基因。红色虚线表示(使用Bonferroni校正进行多重比较调整后)1.49E-07的全基因组显著性阈值(A)或1.01E-07(B)，而黑色虚线表示1.00E-05的提示性显著性阈值。注意y轴是不连续的，上限为300。关于这些结果的更多细节见表1和补充数据2及12。
检测到的全基因组显著STR关联中的大多数(n=153个唯一STR)位于19q13.32染色体19上的APOE区域，这是AD风险的一个已建立且可能是基于SNP的已知风险因素。其余76个STR映射到APOE区域外的13个独立基因座，通常位于已知AD GWAS信号附近(即1.3-138.5kb距离；基于参考文献)。只有一个STR信号(即chr11q13.1)映射到已知AD GWAS信号外的基因间区域(最近的基因为OVOL1和SNX32；图1A，补充图3)。在13个非APOE基因座中的8个中，STR位于蛋白质编码基因的开放阅读框(ORF)内(均为内含子)，而5个位于距最近蛋白质编码基因约5-27kb的上下游(表1，补充数据2)。
关于228个提示性显著STR，在APOE区域外的有大部分(n=178，分布于21个独立基因座)(补充数据3)。其中13个峰值距离任何已知AD位点超过500kb，因此可能至少部分代表新的AD风险信号。在这些13个中，8个位于ORF内(均为内含子)，而其余5个STR映射在距最近蛋白质编码基因约2-310kb的上下游。
为在主要GWAS中搜索性别特异性差异，我们进行了两种类型的分析：首先，我们进行了性别分层GWAS分析，但这些分析未发现任何新信号(补充图26，补充数据18)。其次，我们使用"基因型×性别"交互项进行全基因组交互分析，以搜索在男性与女性中表现出显著关联差异的基因座。同样，没有变异显示全基因组显著交互作用的证据(补充图27)。总体而言，两种分析均未提供主要GWAS信号中性别特异性差异的有力证据。
敏感性分析，包括作为协变量的年龄，显示与未经年龄调整的分析结果高度一致。具体而言，比较调整和未调整的β值的皮尔逊相关系数为r=0.9984(所有变异)和r=1(仅限至少提示性显著变异)(两者：P<2.2E-308；补充图25，补充数据17)。量化将年龄作为协变量带来的"精度增益"(见"方法"部分)表明几乎无标准误差(SE)比例减少，因此无精度增益(中位减少=0.16-0.17%)。该模型中包括年龄对总体效应的影响可忽略不计是意料之中的，因为该变量在此上下文中不被视为混杂因素。
上述结果基于STR的双等位基因编码，由于当前STR填充目录的诸多限制需要大量手动整理(超出本研究范围)，我们采用了这种方法(见"方法"部分)。然而，为排除某些双等位基因信号代表假阳性关联的可能性，我们对±250kb范围内围绕我们提示性和全基因组显著性峰值的所有STR进行了目录的针对性修订，以允许多等位基因分析(见"方法"部分；补充数据4，补充图4)。这些分析显示，14个顶级信号中有12个在多等位基因方法应用后仍保持全基因组显著性，且P值变化极小，但两个信号(chr. 15上，即15:58846596和15:63139195)在应用多等位基因方法后不再显示全基因组显著关联。然而，我们在这些chr. 15基因座内发现了其他附近的STR，均产生全基因组显著信号，即15:58915192，P=2.69E-08和15:63233055，P=1.30E-07，为这些信号的稳健性提供了支持。有趣的是，我们还发现三个STR在±250kb窗口内显示出比初始双等位基因顶级信号更显著的关联，即6:32472900 vs. 6:32611487，11:60251788 vs. 11:60177578，和17:63469860 vs. 17:63485772(补充数据5)。最后，一个在双等位基因方法中仅显示提示性显著的变异在多等位基因方法中显示全基因组显著性(14:52717330)。总之，双等位基因筛选中最初产生全基因组显著关联的14个基因座均在针对性多等位基因分析中得到验证，要么直接(相同STRs，n=12)，要么间接(相邻STRs，n=2)，进一步支持了本研究这一部分主要发现的有效性。
WGS衍生STR的全基因组关联分析
为比较填充与WGS衍生STR数据的GWAS结果，我们利用Halldorsson等人研究中生成的STR基因型。经过严格的样本和变异质量控制步骤(见"方法"部分)，最终可用于GWAS的共有95,201名英国生物银行参与者——代表与填充STR分析中完全重叠的子集(见"方法"部分)——自称"白人-英国"祖先(下文称为"Halldorsson-白人-英国")，包括928名AD和13,759名AD代理病例(补充表2)。在变异层面，共有1,205,675个WGS衍生STR可用于分析。与填充STR不同，对于WGS衍生STR，在全基因组范围内可行双等位基因和多等位基因关联分析(见"方法"部分)。如预期，由于样本量明显较小，信号数量与填充STR的GWAS相比大幅减少(图1B，补充图5，补充数据12)。在双等位基因方法中，72个信号通过了全基因组显著性阈值(alpha=1.01E-07)，但其中只有1个(17号染色体上靠近WSB1的chr17:27264667)位于APOE区域外(rs429358±0.5Mb)。此外，共有60个WGS衍生STR分布在19个基因座，显示提示性关联证据(18个基因座中有25个STR位于APOE区域外)。同样，在多等位基因分析中，38个STR(均在APOE区域内)通过了全基因组显著性阈值。靠近WSB1的双等位基因信号在多等位基因分析中降至P=0.55，表明对于该STR，效应由单个等位基因的大小(chr17:27264667:GA16.5)驱动，而非重复长度变异。
接下来，我们评估了为什么靠近WSB1的新型全基因组显著信号在使用填充STR的GWAS中未出现。检查该STR处的填充基因型数据发现，导致关联信号的等位基因(chr17:27264667:GA16.5)在填充STR数据中未通过QC(由于基因型数据缺失过多)。LD映射(±500kb)显示，该领先变异与任何其他SNP或STR无强烈连锁不平衡(r2>0.2)。
最后，我们调查了靠近ABCA7和SNX32的最有望信号在使用WGS衍生STR的分析中表现如何。由于领先填充STR在WGS衍生STR中不可用，我们在围绕这些STR变异的±500kb区间内进行了成对LD映射。对于靠近ABCA7的信号，我们确定STR chr19:1037970:T14>T11作为合理代理(r2=0.65)。在WGS-GWAS中，该变异显示几乎全基因组提示性关联证据(双等位基因方法：P=7.68E-05，Beta=0.0114；多等位基因方法：P=7.08E-04)，支持靠近ABCA7的AD关联信号主要由STR驱动的总体观点。对于靠近SNX32的信号，STR chr11:65806890:A22:A23处于最强连锁不平衡中(r2=0.91)。该变异在双等位基因和多等位基因分析中均显示与AD的强关联(双等位基因：P=4.98E-04，Beta=-0.0075；多等位基因：P=2.37E-04)，尽管由于WGS基础分析中的样本量较小，显著性可能降低。这两个基因座的结果支持STR在这些区域可能影响AD风险的观点。
主要STR-based GWAS结果的独立复制
为评估发现数据集中发现结果的有效性，我们在白人英国生物银行个体的独立子集("其他白人"；n=20,840；185名AD病例、2803名AD代理病例和17,852名对照；补充表1)中生成了所有全基因组显著STR的类似检验统计量。这些分析显示，最初确定的14个显著STR中有2个在纠正多重检验后显示直接复制证据(即相同效应方向且P<0.05/14；补充数据6)。其余12个STR中，4个显示至少名义复制证据(P<0.05)，所有但一个都显示出相同效应方向。此外，发现和"其他白人"子集的荟萃分析对10/11个基因座(补充数据6)显示了更强的关联(按P值)。因此，14个已识别的全基因组显著STR基因座中有12个(即除MS4A6A和SNX32外的所有)在独立于发现数据集的"白人"个体中显示出直接或间接复制证据。此外，在其他祖先群体的GWAS结果中也有对许多STR基因座的支持(包括SNX32；补充数据6)。然而，我们注意到这些非白人子集的样本量总体较小，AD数量从93到422不等(补充表1)，因此在这些数据中复制证据不可靠。尽管如此，在英国生物银行的"其他白人"子集中进行的独立评估表明，发现GWAS分析中发现的大多数STR效应是稳定且可重复的。
相比之下，WGS衍生STR靠近WSB1在英国生物银行的"Halldorsson-其他白人"子集中未显示与AD风险关联的证据(补充表2)。然而，我们注意到该英国生物包子集中AD病例数量非常少(n=48名AD病例和n=887名AD代理病例)。这，加上相关等位基因频率相对较低(MAF=0.0145)，显著降低了复制分析的效力，因此该基因座缺乏复制也可能是一个假阴性结果。
区分STR-based GWAS信号的驱动因素
鉴于此处使用的STR填充协议依赖于SNP基因型，可以预期某些填充STR GWAS信号实际上是由同一基因座的SNP驱动的。为评估这一假设，我们进行了一系列旨在区分SNP与STR效应的分析(见"方法"部分)。如两个分析的曼哈顿图所示，绝大多数全基因组显著关联峰在±250kb窗口内重叠(补充图6)。然而，使用GCTA-COJO和SuSiE进行精细定位仅提名ABCA7中的STR(COJO：P=5.89E-11；SuSIE：P=5.90E-11，后验包含概率=0.96)作为该区域关联信号的驱动因素(图2)，并揭示了其他基因座的接近调用，包括SNX32(补充数据7)。
接下来，我们使用两种条件分析范式：(i)调整14个潜在STR信号以考虑先前在其他研究中识别的SNP效应(Bellenguez等人，Jansen等人)，以及(ii)反之亦然(见"方法"部分和补充数据8)。在第一种范式中，原始STR信号降至提示性阈值(alpha=1.0E-05)以下(补充数据8，图2，补充图7-19)，但我们注意到两个STR(靠近MINDY2/ADAM10和靠近ABCA7)在调整后显示出残留的、几乎提示性的关联(P=3.36E-05和P=4.23E-05，分别；补充数据8，图2)。STR信号的效应大小从-1.6E-02(SE=2.9E-03)略微降至-1.3E-02(SE=3.0E-03)，以及从9.6E-03(SE=1.5E-03)降至7.4E-03(SE=1.8E-03)，分别。残留P值结合效应大小的相对较小减少表明，在考虑局部SNP效应后，STR可能对该区域已知遗传关联信号做出实质性贡献。有趣的是，我们也观察到相反的情况，即某些STR在调整SNP效应后显示出更强的关联证据。HLA-DRB1(六个STR)和ABCA7(一个STR)基因座就是这种情况(补充数据9)。在APOE中也遇到了类似情况，其中一个STR(chr19:44910674)的P值从名义显著(P=9.33E-03)变为全基因组显著(P=4.67E-23)(补充数据10)，这是在调整APOE中"e4等位基因"(rs429358)后发生的。这种统计支持的增加至少部分归因于APOE中"e2等位基因"(rs7412)的效应，该等位基因与相关STR等位基因高度连锁不平衡(r2=0.71)。
有趣的是，当应用相反的范式时，即调整SNP效应以考虑STR效应，衰减的关联证据看起来类似(补充数据8，补充图7-19，图2)，即除APOE和另外两个SNP外，所有SNP信号下降，但在调整STR效应后仍显示提示性关联信号，可能表明STR也对领先SNP信号做出贡献。我们注意到，这些分析的明确解释受到以下事实的阻碍：在本研究的这一部分，SNP和STR基因型本质上是高度相关的(与使用WGS衍生STR的分析相反)。对于提示性STR，这些分析总体上产生了类似的图像，与全基因组显著基因座相比，更多STR在SNP调整后"存活"(补充数据11)。
在WGS衍生双等位基因STR信号靠近WSB1的条件分析中，包括该区域最强SNP(rs117222268来自参考文献)后，STR关联在调整后仍保持全基因组显著性(P=1.77E-08；补充数据13)。此外，在APOE区域内的71个WGS衍生全基因组显著STR信号中，我们强调STR chr19:44921083:A11:A13，其紧邻另一个STR(chr19:44921097-44921125:TTTAn)，该STR已在先前工作中被报道与AD相关。使用rs429358进行条件分析导致STR信号降至P=0.01，表明该STR不产生超出著名e4等位基因的遗传效应。然而，使用APOE rs429358调整该区域内STR信号导致相同STR的效应大小和关联显著增加，该STR在填充数据集中也观察到类似情况(chr19:44910661，这至少部分可能归因于APOE中"e2等位基因"的效应，如上所述)。此处，P值从调整前的1.34E-01增至调整后的2.38E-08(补充数据19)。这些发现，加上文献中的现有数据，表明对APOE区域一般贡献AD风险的遗传架构可能超越e4等位基因的效应，在未来工作中值得详细精细定位。
STR与SNP比较的遗传度估计
为估计STR对阿尔茨海默病遗传架构的贡献，超出显示全基因组显著关联证据的基因座，我们使用GCTA-LDMS方法计算了全基因组遗传度估计(见"方法"部分)。使用0.05的AD人群患病率和MAF>0.01，这导致SNP基础遗传度平均为37.05%(SD=2.7%)，与使用GCTA进行遗传度估计的其他研究中的近期估计值(31%)一致。我们注意到，GCTA-LDMS算法通常返回数值上高于LDSC方法的遗传度估计，后者也常用于SNP-based GWAS(在参考文献中进行了回顾)。对STR基因型进行等效平均遗传度计算得到30.78%(SD=2.8%)的估计。包括SNP和STR的平均估计值在38.09%(SD=2.99%)处达到最大值。因此，STR至少贡献了阿尔茨海默病总遗传度的~3%(即(h(SNP+STR)-h(SNP))/h(SNP+STR))(补充表3)，这一估计值略小于其他复杂性状。我们注意到，17批遗传度估计的标准差为2.98%，相对于平均值而言相对较大。STR对绝对遗传度的相对贡献较小可能是高方差的一个可能原因。因此，贡献指标对不同子集之间的微小自然变化变得敏感，应谨慎解释。值得注意的是，即使使用替代患病率值(此处：0.1、0.2、0.3)，STR对阿尔茨海默病总遗传度的估计贡献仍稳定在~3%。尽管如此，考虑到该数据集中SNP和STR之间广泛的相关结构，一些真正的STR效应可能被SNP基因型掩盖。因此，我们认为~3%代表了STR对AD遗传度贡献的下限。
比较填充与WGS衍生STR
为评估填充STR的一般有效性，我们将STR-based GWAS结果与使用WGS衍生基因型数据的结果进行了比较。为此，我们决定主要比较GWAS检验统计量，因为在全基因组水平上直接比较STR基因型受到多种因素的阻碍(见下文和"方法"部分)。如预期，与发现GWAS相比，关联证据总体上不太明显(比较图1A、B)，这可能归因于WGS衍生与填充数据集相比的样本量明显较小(n=95,201 vs. 295,551)。接下来，我们在WGS子集中(n=95,201；补充图20)重复了填充STR的GWAS分析，并评估了两种分析集效应大小的相关性。此比较仅限于约622K STR，即所有可通过基因组位置和等位基因长度唯一匹配的STR(见"方法"部分，补充图22A)，并显示两种类型变异的效应大小(斯皮尔曼秩相关)高度显著相关(r=0.85，P<2.2E-308)。为专门评估顶级关联STR的GWAS结果的有效性，我们手动整理(通过匹配等位基因、对齐位置与UCSC坐标、检查可能映射在重复序列内的SNP)了各自GWAS中P<1.0E-05的所有WGS衍生和填充STR(见"方法"部分)。这导致n=84个匹配变异，GWAS衍生效应大小估计显示近乎完美相关(斯皮尔曼r=0.99，P=8.77E-79；补充图21和22B)。这些比较强调了STR填充过程的总体高质量，并表明，至少对于一组强关联STR，产生的GWAS检验统计量高度可靠。
为更直接比较填充与WGS衍生STR的基因型，我们还比较了这两个STR子集的参考等位基因频率(即针对通过位置匹配的约622K STR和通过手动整理匹配的84 STR)。同样，这些分析显示填充和WGS衍生变异之间高度相关(r=0.96[P<2.2E-308]和r=0.98[P=1.12E-59]，分别，补充图23)。最后，我们通过比较填充基因型和WGS衍生基因型每基因座等位基因长度总和来评估填充质量(补充图24)。每基因座等位基因长度总和的斯皮尔曼相关性显示，n≈622k集的平均r=0.89和n=84集的平均r=0.91。为使与Margoliash等人发表的数据直接可比，我们还计算了皮尔逊相关系数。对于n≈622k集，r2值>0.8的STR位点占69%，>0.9的占48%。虽然这些数字低于Margoliash等人中等效指标的报告值(r2>0.9占78.7%，r2>0.8占92.7%)，但我们注意到我们的分析基于更大的变异池，即>600K STR vs. Margoliash等人中的仅408个。
阐明AD相关STR的潜在功能机制
如上所述，大多数确定与AD风险相关的STR位于或非常接近蛋白质编码序列的开放阅读框(ORF)。因此，关联的潜在功能后果可能是对基因表达的影响。作为评估这一假设的第一步，我们仔细检查了所有在主要GWAS分析中显示全基因组显著性的STR，以评估其对人脑样本(内嗅皮层；n=145和173)中DNA甲基化(DNAm)或基因表达的潜在影响。
为此，我们分析了全基因组显著STR位点±1Mb窗口内(即cis内)的所有CpG。分析后，使用Benjamini–Hochberg程序(FDR控制在5%)控制结果P值。使用此阈值，6个STR位点显示与脑中31个CpG位点的关联(其中26个是独特的；补充数据14)。最有趣的STR meQTL发现之一(总结在补充数据14中)是在7号染色体7q22上观察到的，位于NYAP1基因(预测参与神经元投射形态发生)和PILRB基因(参与免疫系统功能，已与AD在先前多项研究中关联)之间的CpG。meQTL关联由STR chr7:100326718:CT:C驱动，与两个CpG强关联(cg06214670[P=4.63E-09]和cg03579757[P=3.27E-09])。此外，还观察到与映射在或靠近HLA相关基因(6号染色体6p22)的CpG的多个meQTL关联，特别是HLA-DRB1(例如，cg08845336[P=1.33E-14]位于HLA-DRB1外显子2内)，其参与适应性免疫反应，是AD和其他神经退行性疾病的新兴候选基因。最后，我们还在SNX32第一内含子的近端增强子元件中发现了STR-based meQTL的有力证据(cg15531562[P=7.07E-13])，SNX32是参与神经突生长调控的基因，代表我们在发现GWAS分析中确定的一个新的STR相关AD基因座。
此外，我们通过探测meQTL分析中出现的所有CpG与映射在人类内嗅皮层(EC)样本中±25kb内mRNA表达之间的潜在直接相关性进行了表达定量甲基化(eQTM)分析(补充数据16)。这些分析显示两个基因座显示FDR显著的DNAm-mRNA相关性，涉及多个CpG和HLA相关基因，以及靠近SNX32的STR基因座(补充数据16)。后者是cg15531562(SNX32，第一内含子)与SNX32转录本ENST00000308342之间的关联，显示非典型效应方向，其中基因体部分区域DNA甲基化减少与基因表达水平降低相关，反之亦然。这正是我们在本研究中观察到的，即DNAm与SNX32 mRNA表达呈正相关(EC：r=0.523，P=0.0047；图3A，补充数据16)。同一CpG还显示与CFL1中的转录本呈FDR显著相关，尽管效应大小略小于SNX32(补充数据16)。
接下来，我们使用从相同脑样本(n=173)进行的RNA测序实验中获得的基因表达谱计算了STR基础表达QTL(eQTL)分析。对于每个STR，我们探测了与±1Mb窗口内基因的关联，再次使用FDR调整。总体而言，meQTL和eQTL结果之间有很好的对应关系，四个STR-mRNA对在FDR校正后达到全基因组显著性(补充数据15)。其中，最强且最一致的eQTL信号再次在6号染色体6p22上的HLA区域观察到。虽然我们未检测到SNX32的FDR显著eQTL关联，但我们注意到STR chr11:65810443:TCA:T与SNX32转录本ENST00000308342之间存在强烈的名义关联(P=0.00067，效应方向为正[Beta=0.25]，与meQTL结果一致)。未来工作需要在更大的基于脑的数据集中跟进这些meQTL、eQTM和eQTL线索。如"方法"部分所述，我们未在eQTL/meQTL分析模型中测试其他数量的PC，这是本研究这一部分的潜在限制。
讨论
本研究中，我们在约33万名英国生物银行个体的大型集合中进行了AD的STR-based GWAS。在使用填充STR数据的分析中，我们识别出14个显示与AD风险全基因组显著关联的基因座，最强效应由APOE区域中的STR引起。在约2万名英国生物银行个体的子集中进行复制测试为这14个基因座中的所有但一个提供了独立支持。在英国生物银行队列中所有全基因组显著信号中，有一个STR(而非SNP)代表主要关联信号(ABCA7)，四个STR对SNP驱动的AD风险关联显示出显著贡献(HLA-DRB1、ADAM10、SNX32和APOE)。使用WGS衍生STR的GWAS分析导致识别出一个额外的全基因组显著基因座(靠近WSB1)，先前未被基于SNP的GWAS突出显示。GWAS后分析表明，STR在该数据集中至少构成AD总遗传变异的3%。最后，将我们的顶级STR与独立人脑样本的全基因组DNAm和转录组谱型对齐表明，几个已识别的STR可能通过影响附近基因的表达来发挥其作用。
我们的研究报道了三个主要值得注意的发现。首先，我们检测到两个新的潜在STR-based GWAS信号用于AD，即靠近OVOL1/SNX32的chr. 11q13和靠近WSB1的chr. 17q11。这些位点±0.5Mb范围内没有已知AD SNP-based GWAS结果映射，使其成为新型信号。尽管这两个位点都包含有希望的AD候选基因(见下文)，但我们注意到，它们均未在英国生物银行数据集的"其他白人"子集中独立复制(但其他祖先群体对OVOL1/SNX32有支持)。第一个信号由填充STR(chr11:65810443:TCA:T；P=7.01E-08)暗示，靠近OVOL1(~13.2kb上游)和SNX32(~23.5kb下游)。虽然我们的文献检索未发现OVOL1与AD的明显联系，但SNX32的情况则不同。该基因编码sorting nexin 32，在大脑中高度(且主要)表达。与AD相关的STR还代表了本研究中最强的基于脑的meQTL信号之一，与SNX32注释的CpG(P=7.07E-13)。此外，我们表明STR相关CpG cg15531562上DNAm水平增加与人脑组织中SNX32 mRNA水平增加相关(图3)。基于这些结果，我们假设携带STR chr11:65810443:T(CA)5的五重复等位基因导致cg15531562上DNAm水平降低(位于SNX32第一内含子内；beta=-0.0291)，进而导致SNX32 mRNA表达降低(图3)。这些观察结果与两项最近的功能研究非常吻合，表明SNX32蛋白水平降低与AD有因果关系。最后，第三项研究表明SNX32蛋白水平降低对神经突生长产生负面影响，再次支持我们的观察，即该基因座风险增加可能导致SNX32 mRNA表达降低。
第二个位点映射到chr. 17p22，由WGS衍生TG二核苷酸STR引起。其映射到WSB1基因上游约29.4kb，进入H3K27Ac标记，指示活性增强子元件。WSB1 mRNA广泛表达，包括在大脑中。功能上，编码蛋白是WD蛋白亚家族的成员，可能是SCF样ECS(延伸素-连环蛋白-SOCS盒蛋白)E3泛素连接酶复合物的底物识别组分，介导靶蛋白的泛素化和随后的蛋白酶体降解。因此，它参与泛素-蛋白酶体系统(UPS)的正常功能，该系统在AD中病理性蛋白(包括Aβ和tau)的积累中也起中心作用。由于其低MAF(~0.01)和该染色体区域复杂的基因组架构，独立复制测试要么无信息，要么不可能。
我们研究的第二个主要发现强调了两个先前建立的AD遗传基因座，即靠近ABCA7(chr. 19p13)和MINDY2/ADAM10(chr. 15q21)，其中STR要么代表主要关联信号，要么对已知SNP效应做出强贡献。首先，ABCA7中的SNP长期以来已确定与AD风险相关。各种比较性GWAS后分析表明，STR——可能比SNP更甚——可能是这一信号背后的驱动因素。对第二个位点，即包含MINDY2和ADAM10的区域，也做出了类似观察。尽管遗传证据更多指向MINDY2，但该区域中的第二个基因ADAM10(编码α-分泌酶，即解整合素和金属蛋白酶10)，作为构成性α-分泌酶切割淀粉样β蛋白前体(APP)蛋白的非淀粉样蛋白生成途径，在功能上似乎更具说服力。
第三个主要发现与HLA/MHC区域内各种STR-based关联信号相关。此处，填充和WGS衍生STR的GWAS结果表明关联信号在条件于顶级GWAS SNPs后仍比反之更强，表明STR可能比SNP对AD风险做出更显著的贡献。此外，相同STR还在人内嗅皮层样本中显示出与DNAm和基因表达的强且一致关联。所有这些关联信号均由STR chr6:32611487:TCTTTCTTTC:T驱动，该STR降低AD风险(beta=-0.0090，P=1.23E-08)和DNAm(在cg26036029；beta=-0.1391，P=3.57E-12)，同时增加脑中HLA-DQA2的表达(转录本ENST00000374940；beta=0.2810，P=2.07E-07)。此外，在该区域还观察到两个WGS衍生STR的强eQTL信号(P=1.07E-06)。因此，该区域在遗传(GWAS)、甲基组(meQTL)和转录组(eQTL)水平上存在显著的一致性发现，强烈支持这一发现的真实性。
我们仅知道另外两项涉及AD的STR关联研究。虽然Manigbas等人使用了相对较大且部分与英国生物银行重叠的子集(~17万名个体)，但他们的研究仅限于相对较小的一组(~36K)高质量多态性STR。这可能解释了为什么作者在他们的AD风险分析中未识别出任何全基因组显著信号。相比之下，Guo等人的研究在相对大量的STR(~300K)上进行了关联测试，但仅使用了相对较少的样本(~3K)。可能由于样本量小，Guo等人仅检测到APOE区域内STR的全基因组显著关联(这与我们靠近APOE的发现相当)。Guo等人强调的APOE STR(chr19:44921098)也在我们的WGS基础数据中显示全基因组显著性；事实上，其P=2.99E-236，代表WGS基础部分的第三强信号。此外，其与我们的WGS基础数据中最强STR仅相距14bp(chr19:44921083，P=5.69E-303)。成对LD分析显示两种变异之间强相关(r2=0.75和D'~1)，表明两种STR可能捕获相同的关联信号。通过实施STR填充，我们的研究通过使用比先前论文更大的样本量(~33万名)和STR数量(~300万个变异，其中33.5万个独立)最大化了功效。
尽管其优势，我们的研究也存在几个潜在限制。首先，我们主要和最强大的GWAS分析(在约33万名个体中)基于填充STR基因型。虽然填充AD相关STR与WGS的比较表明GWAS检验统计量高度相关(证实了我们主要发现的有效性)，但需要注意的是，当前STR填充范式尚未达到SNP填充实现的同样高质量。其次，为简化统计分析，我们将多等位基因STR拆分为双等位基因STR，这可能降低了在某些基因座检测关联信号的效力。然而，我们注意到，此程序不会使此处报告的任何双等位基因关联信号失效。对于双等位基因测试中关联的STR，我们随后计算了针对性多等位基因关联分析。这些分析确认了除两个外的所有最初识别的STR基因座，两个都位于染色体15q21-22之间的相同4.5Mb区间内(介于MINDY2/ADAM10和LACTB之间)。双等位基因发现未在chr.15上得到确认可能是因为双等位基因信号代表"固定"在常见单倍型中的一个等位基因的效应，而该STR位点的其他等位基因无效应。然而，我们注意到，这并不使这些区域中的初始双等位基因结果失效，因为我们识别出其他高度显著的多等位基因信号与其他映射到相同基因座的STR。第三，STR基因型数据的多等位基因性质不允许运行广义混合模型方法，该方法允许包含相关个体。因此，我们的GWAS计算仅限于不相关个体，与标准SNP-based分析相比，这导致有效样本量(和统计效力)降低。第四，最近显示此处使用的代理表型方法在GWAS背景下可能是某些偏倚的来源，主要通过可能膨胀或扭曲特征间遗传相关性的估计。重要的是要强调，仅对GWAS基因座的"发现"检测到可忽略的偏倚，这正是此处使用代理表型的方式。这也是我们在本研究中观察到的，即包含和不包含约4.3万名代理AD病例的GWAS分析计算的效应大小(β值)相关(皮尔逊r=0.8(全部)和r=0.99(至少提示性显著变异))。第五，我们的分析主要关注英国生物银行中欧洲("白人")祖先的个体。这些祖先群体代表此处包含的英国生物银行发布中最大的子集。虽然我们的一些顶级STR GWAS信号在英国生物银行中可用的其他祖先中直接或间接复制，但这些分析基于相对较小的样本量(最多包含约400名AD和AD代理病例)。第六，对于本研究，我们未考虑罕见STR。尽管这些STR将非常有趣，但低频STR仅在"Halldorsson-白人-英国"子样本中可用。仅928名诊断和13,759名代理AD病例的样本量将提供非常低的检测全基因组显著关联的效力，因此我们决定不在GWAS分析中包含它们。最后，虽然我们能够通过使用独立人脑样本的全基因组DNAm和转录组谱型阐明我们顶级STR-based关联信号的一些初步假设机制，但后者数据集相对较小(nmax~173)且仅包含一个脑区(内嗅皮层)。
总之，我们的研究构成了AD风险的大规模STR-based GWAS。除检测到两个潜在新型且功能有趣的AD基因座(靠近SNX32和WSB1)外，我们的结果表明STR可能强烈贡献于四个额外基因座(ABCA7、MINDY2/ADAM10、HLA-DRB1和APOE)的遗传效应。此外，我们估计STR至少构成AD遗传方差的3%。需要未来研究，理想情况下在大型AD数据集中使用直接基因分型STR，以确认我们的结果并进一步阐明STR在AD遗传构成中可能扮演的相当大的角色。
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