摘要
背景
自身免疫性疾病（如系统性红斑狼疮[SLE]、特发性炎性肌病和系统性硬化症）的治疗通常需要长期免疫抑制。通过深度清除B细胞来重置这些疾病中的异常自身免疫，是实现持续无药物缓解的潜在策略。
方法
我们评估了15例严重SLE（8例）、特发性炎性肌病（3例）或系统性硬化症（4例）患者，他们在氟达拉滨和环磷酰胺预处理后接受了单次CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞输注。通过SLE缓解定义（DORIS）标准、美国风湿病学会-欧洲抗风湿病联盟（ACR-EULAR）重大临床反应以及欧洲硬皮病试验与研究组（EUSTAR）活动指数评分（评分越高表示疾病活动度越高）等指标评估CAR T细胞输注后长达2年的疗效。记录包括细胞因子释放综合征和感染在内的安全性变量。
结果
中位随访时间为15个月（范围4-29）。B细胞再生障碍的平均（±SD）持续时间为112±47天。所有SLE患者均达到DORIS缓解，所有特发性炎性肌病患者均达到ACR-EULAR重大临床反应，所有系统性硬化症患者的EUSTAR活动指数评分均下降。所有患者均完全停用免疫抑制治疗。10例患者出现1级细胞因子释放综合征。各有1例患者出现2级细胞因子释放综合征、1级免疫效应细胞相关神经毒性综合征和需要住院治疗的肺炎。
结论
在本病例系列中，CD19 CAR T细胞输注在三种不同的自身免疫性疾病中展现出可行性、安全性和有效性，为后续进一步开展对照临床试验提供了依据。（由德国研究基金会等资助。）
正文
嵌合抗原受体（CAR）T细胞已成为治疗癌症的强大工具。特别是，通过CAR T细胞靶向恶性B细胞显著改善了血液系统肿瘤的治疗。除了恶性B细胞外，自身反应性B细胞也可导致严重的病理效应，即自身免疫性疾病。系统性红斑狼疮（SLE）、特发性炎性肌病和系统性硬化症等疾病以慢性炎症、器官损伤和死亡率增加为特征。以长期缓解为目标的自身免疫性疾病治疗仍然具有挑战性。目前的干预策略不能充分控制潜在的自身免疫过程，并且涉及长期免疫抑制药物治疗。长期以来，针对自身免疫性疾病中B细胞的靶向治疗仅限于抗体，这些抗体要么清除B细胞（例如通过结合B细胞特异性表面分子CD20），要么抑制其活化（例如通过结合B细胞活化因子）。尽管基于抗体的B细胞靶向治疗确实改善了自身免疫性疾病的治疗，但实现持久的无药物缓解仍然难以实现。CAR T细胞可能通过靶向广泛表达于B细胞和浆母细胞表面的CD19分子来深度清除B细胞，从而实现这一目标。在过去的两年中，多个病例和一项小型病例系列研究提示了CD19 CAR T细胞疗法在自身免疫性疾病中的可行性和短期疗效。在此，我们报告了15例患有三种不同严重自身免疫性疾病的患者接受CD19 CAR T细胞治疗的短期和长期疗效及安全性数据。
方法
患者
患者招募和特征的详细信息见补充附录（本文全文可在NEJM.org获取）。方案也可在NEJM.org获取。患者必须已确诊SLE、特发性炎性肌病或系统性硬化症；病程严重且呈进行性；并且对至少两种不同的标准免疫调节治疗耐药。CAR T细胞疗法是通过德国危重患者的扩大准入计划提供的。所有患者均根据CARE病例报告指南并遵循《赫尔辛基宣言》原则提供了书面知情同意书。
CAR T细胞制备与治疗
CD19 CAR T细胞制备和治疗程序的详细信息见补充附录。研究性药品MB-CART19.1由自体CD19 CAR转导的CD4和CD8富集T细胞组成，来源于白细胞分离产物，并使用CliniMACS Prodigy设备处理。患者接受氟达拉滨和环磷酰胺的淋巴细胞耗竭化疗，如补充附录所述。
临床评估与随访
SLE疾病活动度通过系统性红斑狼疮疾病活动指数2000（SLEDAI-2K；范围0-105，评分越高表示疾病活动度越高）、狼疮低疾病活动状态（LLDAS）标准和SLE缓解定义（DORIS）缓解标准在CAR T细胞输注后每3个月评估一次。此外，每3个月评估尿蛋白排泄量、补体因子C3水平和双链DNA（dsDNA）抗体水平。在特发性炎性肌病患者中，每3个月记录2016年美国风湿病学会-欧洲抗风湿病联盟（ACR-EULAR）总改善评分、肌酸激酶水平、手动肌肉测试-8（MMT-8）评分和肌肉外疾病活动度评分。ACR-EULAR总改善评分范围为0-100，0-19表示无临床反应，20-39表示轻微临床反应，40-59表示中度临床反应，60-100表示重大临床反应。在系统性硬化症患者中，每3个月通过欧洲硬皮病试验与研究组（EUSTAR）活动指数评分（范围0-10，评分越高表示疾病活动度越高）和改良Rodnan皮肤评分（范围0-51，评分越高表示皮肤纤维化越严重）评估临床反应。
临床与安全性评估
在CAR T细胞输注后的前10天内，每天对患者进行细胞因子释放综合征和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）的筛查。细胞因子释放综合征和ICANS根据美国移植与细胞治疗学会共识标准进行评估。骨髓毒性定义为CAR T细胞治疗后持续超过28天的III级或IV级中性粒细胞减少症或白细胞减少症。不良事件评估的进一步详细信息见补充附录。CAR T细胞和白细胞亚群的监测、自身抗体定量、疫苗相关抗体和B细胞分析的详细信息也见补充附录。
结果
患者特征
从2021年2月到2023年5月，共有15例难治性系统性自身免疫性疾病患者（8例SLE，3例特发性炎性肌病，4例系统性硬化症）接受了CD19 CAR T细胞治疗。关于CAR T细胞疗法对SLE患者1-5、特发性炎性肌病患者1-2和系统性硬化症患者1的短期初步效果此前已有报道。
基线时患者特征总结于表1。所有患者对至少2种既往免疫抑制治疗反应不足（中位数为5种，范围2-14）。SLE患者疾病活动，中位SLEDAI-2K评分为13（四分位距，9.3-16），至少有一个英国狼疮评估组（BILAG）2004指数A评分（严重），并存在经组织学证实的WHO III级或IV级肾小球肾炎。所有特发性炎性肌病和系统性硬化症患者均患有间质性肺病，伴有用力肺活量降低（中位数分别为53%[四分位距，49-64]和36%[四分位距，24-53]）和一氧化碳弥散量降低（中位数分别为67%[四分位距，49-75]和59%[四分位距，34-72]）。特发性炎性肌病患者表现出活动性肌肉受累（中位肌酸激酶水平4298 U/L；四分位距，766-9305），而系统性硬化症患者皮肤受累活动（中位改良Rodnan皮肤评分25.5；四分位距，18.8-30.8）。8例患者曾接受过B细胞清除剂，9例患者曾接受过环磷酰胺（中位剂量3 g；四分位距，1-6；平均[±SD] 5.3±6.9 g）。CAR T细胞治疗前免疫抑制药物序贯治疗的详细信息见图S1（补充附录）。
15例患者中，细胞制备过程中的增殖情况（图S2A和S2B）、转导效率（图S2C）以及个体自体CD19 CAR T细胞产品的细胞组成（图S2D）高度一致。所有15例患者均能生产超过1×10^9个CD19 CAR T细胞，转导效率介于18%和44%之间。大多数CD19 CAR T细胞产品（除SLE患者8和系统性硬化症患者1和4外）含有比CD8+ T细胞更多的CD4+细胞。
CAR T细胞扩增与B细胞清除
输注后，CAR T细胞在体内迅速扩增，平均8.6±0.8天（中位9天；四分位距，9-9）达到峰值浓度（图S3A）。在扩增峰值时，循环CAR T细胞的中位数为146个/μL（四分位距，61-697）。CD19+ B细胞在平均5.9±2.2天（中位7天；四分位距，3-7）后从外周血中迅速清除。14/15例患者的B细胞在平均112±47天（中位100天；四分位距，72-153）后重新出现，最后一位患者（系统性硬化症患者4；随访128天）仍在等待B细胞重建（图S3B）。对白细胞和淋巴细胞计数影响的详细信息见补充附录，包括图S3C和S3D。
既往暴露于B细胞清除抗体的患者（见补充附录）与未暴露者相比，基线的B细胞计数更低，B细胞再生障碍时间更长（中位数138天[四分位距，66-189] vs. 86天[四分位距，70-124]）（表S1）。此外，既往接受过利妥昔单抗治疗的患者CAR T细胞扩增峰值低于未接受者（中位数91个细胞/μL[四分位距，38-270] vs. 461个细胞/μL[四分位距，61-1275]）。既往接受过利妥昔单抗治疗的患者血液中CAR T细胞的存在时间短于未接受者（中位数40天[四分位距，30-61] vs. 58天[四分位距，26-79]）。
短期与长期疗效
CD19 CAR T细胞给药后，定期监测患者疾病活动度。所有8例SLE患者在6个月后均达到LLDAS标准并实现DORIS缓解（图1A）。6个月后SLEDAI-2K评分等于零。基线和随访时的BILAG状态分析显示，6个月后所有主要疾病类别的SLE均得到缓解（图S4）。长达29个月的长期随访显示，所有8例SLE患者的疾病活动度持续消失（SLEDAI-2K评分0）（图1B）。此外，在整个观察期间，抗dsDNA抗体消失并保持阴性，补体因子C3水平恢复正常，蛋白尿消失。SLE患者4在CAR T细胞治疗后4个月出现蛋白尿反弹，随后的肾活检未显示任何狼疮性肾炎的组织病理学征象（但伴有足细胞病），该患者未复发，末次随访（24个月）时仅存在极轻微蛋白尿。
所有3例特发性炎性肌病患者在3个月后均达到ACR-EULAR重大临床反应，肌酸激酶水平恢复正常，并维持这些反应（图1A和1C）。所有3例患者的肌肉功能（MMT-8测量）恢复正常，肌肉外疾病活动停止（图1C）。在4例系统性硬化症患者中，所有患者的全球疾病活动度（EUSTAR活动指数评分测量）和皮肤活动度（改良Rodnan皮肤评分测量）均下降。在至少随访6个月的3例患者中，EUSTAR活动指数评分的中位变化为-4.2分（四分位距，-4.7至-2.3），改良Rodnan皮肤评分的中位变化为-9分（四分位距，-17至-7）（图1A和1D）。截至末次随访（中位15个月；四分位距，7-19），所有15例患者均成功停用糖皮质激素和所有其他免疫抑制药物。
抗体库分析
SLE患者的自身抗体库分析显示，抗dsDNA、单链DNA、次级坏死细胞、核小体和Smith蛋白的抗体发生血清转换（图2A）。对至少随访1年的SLE患者（8例中的7例）的自身抗体长期分析证实，SLE特异性自身抗体持续缺失（图S5A）。抗核抗体和抗Ro60抗体的评估见图2B，特发性炎性肌病或系统性硬化症患者疾病相关自身抗体的详细分析见图2C。
针对标准疫苗（包括破伤风、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘-带状疱疹病毒和EB病毒）的保护性IgG反应保持稳定，而长期观察中发现针对肺炎球菌和严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的抗体中度下降但未消失（图2D）。在CD19 CAR T细胞治疗和B细胞重建后，针对SARS-CoV-2（2例患者）、肺炎球菌（1例患者）和破伤风（2例患者）的疫苗接种导致抗原特异性IgG水平随后升高。SLE患者抗疫苗抗体反应的长期分析结果见图S5B。
B细胞表型分析
在基线、CAR T细胞治疗后4个月和12个月进行B细胞亚群分析。荧光激活细胞分选分析中B细胞的门控策略见图S6。在4个月和12个月时重建的B细胞呈现幼稚B细胞表型，而CD19+CD27+记忆B细胞显著减少（图3A）。在4个月至12个月期间，CD19+CD27+记忆B细胞有有限增加，主要见于转换前IgD+CD27+ B细胞。B细胞重建后未发现CD27+CD38+浆母细胞和SLE相关活化CD11c+记忆B细胞。指示骨髓B细胞重建的未成熟CD38+ B细胞在4个月时增加，之后下降。特发性炎性肌病和系统性硬化症患者中观察到类似结果，尽管在4个月和12个月时记忆B细胞的清除似乎不如SLE患者深（图3B和3C）。基于单细胞测序的免疫球蛋白重链和轻链分析细节见补充附录，包括图S7和S8。
短期与长期安全性
未发生中度或重度细胞因子释放综合征或ICANS。在短期安全性方面，15例患者中有11例出现细胞因子释放综合征，其中10例为1级（发热），1例为2级（特发性炎性肌病患者3）（表2）。细胞因子释放综合征在中位1天（四分位距，1-7）后开始，持续中位5天（四分位距，2-7）。15例患者中有6例接受了托珠单抗治疗（（接上文）
）托珠单抗治疗（SLE患者8例中的3例，特发性炎性肌病患者3例中的3例，系统性硬化症患者4例中的0例）。体温、血压、心率及C反应蛋白水平的详细信息见图S9。1例患者（特发性炎性肌病患者2）在输注后2周出现头晕，被判断为可能为轻度ICANS，经糖皮质激素治疗后缓解。所有患者均未发生延长（>28天）或双相骨髓抑制。1例患者在CD19 CAR T细胞治疗后120天出现4级中性粒细胞减少症（白细胞计数1710/μL，中性粒细胞计数200/μL），停药舍曲林、普瑞巴林和多沙唑嗪，并接受3次3000万单位粒细胞集落刺激因子注射后缓解。淋巴细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和自然杀伤细胞恢复的详细信息总结于图S10。
在长期安全性方面，记录了感染事件（表3）。SLE患者8在CAR T细胞治疗后7周因肺炎入院，经抗生素治疗后痊愈。所有其他感染均为轻度，主要表现为上呼吸道感染。新发低丙种球蛋白血症不常见。免疫球蛋白的详细信息见补充附录，包括图S11。
讨论
这些数据为CD19 CAR T细胞疗法在严重自身免疫性疾病患者中的可行性、初步疗效和副作用特征提供了证据。尽管疾病实体和既往治疗存在差异，但患者间CAR T细胞扩增动力学和B细胞消融动力学高度一致。CD19 CAR T细胞疗法对既往单克隆抗体靶向B细胞治疗同样有效。由于单克隆抗体靶向B细胞治疗并未被批准用于SLE、特发性炎性肌病和系统性硬化症，因此既往暴露于此类药物并非治疗的必要条件。在SLE和特发性炎性肌病患者中，观察到疾病症状完全缓解，而系统性硬化症患者则表现为皮肤和肺部疾病严重程度减轻。值得注意的是，所有患者均成功停用免疫抑制药物，未出现复发或疾病恶化。
鉴于患者在长达2年完全重建B细胞后未出现复发，单次CD19 CAR T细胞注射似乎能够诱导持久的缓解。这种稳定的缓解状态也得到自身抗体持续减少的支持，而自身抗体通常先于自身免疫性疾病发病。此外，幼稚非类别转换B细胞系统的出现、循环浆母细胞的消失以及特定疾病相关重链和轻链的下调，支持了CD19 CAR T细胞疗法可能诱导了这些患者病理性自身免疫重置的概念。因此，尽管CAR T细胞疗法同时针对致病性和非致病性B细胞，但在CAR T细胞消失后，B细胞系统的重启显然是在缺乏触发自身抗体产生的致病性B细胞的情况下发生的。
所有患者均接受了氟达拉滨和环磷酰胺的淋巴细胞耗竭化疗。不能排除这种治疗对CD19 CAR T细胞治疗的短期效果有所贡献。然而，单纯的淋巴细胞耗竭化疗极不可能诱导完全的B细胞清除、自身抗体消失和持续的无药物缓解。许多患者在CAR T细胞给药前曾暴露于显著更高剂量（>5g）的环磷酰胺，但未显示临床效果。氟达拉滨已在SLE和特发性炎性肌病的小型病例系列中进行了测试。其剂量是我们研究中使用的淋巴细胞耗竭方案的6倍，但对特发性炎性肌病患者无效，并在SLE患者中诱导了严重的骨髓毒性作用。此外，除B细胞外，所有白细胞谱系在淋巴细胞耗竭化疗后3周内迅速恢复，使得该方案的持续效果极不可能。然而，自身免疫性疾病需要何种剂量以及是否需要进行淋巴细胞耗竭，仍需进一步探索。
CD19 CAR T细胞治疗的不良反应极小，未发生高级别细胞因子释放综合征或ICANS，也未发生延长骨髓毒性作用。此外，感染发生率低，总免疫球蛋白水平仅中度下降。尽管如此，对这些患者进行仔细监测仍是必要的，因为免疫球蛋白水平有一定程度的下降，并且在随访期间发生了感染。尽管CD19 CAR T细胞治疗后免疫球蛋白水平下降是由于抗体产生浆母细胞被清除，但血清免疫球蛋白的相当一部分（如疫苗相关抗体）并未被清除，这意味着CD19阴性浆细胞可能未受到该疗法的显著影响。类似的结果，提示抗体产生的不同来源（浆母细胞 vs. 浆细胞），也已从使用B细胞清除抗体治疗SLE的研究中获得。由于长寿命浆细胞受CD19 CAR T细胞疗法的影响较小，是否需要新的疫苗接种以及疫苗接种将如何影响记忆B细胞室的恢复，仍然是一个悬而未决的问题。
尽管这些数据为CD19 CAR T细胞疗法在自身免疫性疾病中的短期和长期安全性及有效性提供了新的证据，但仍需进行对照临床研究。虽然判断这些患者是否确实从其自身免疫性疾病中治愈还为时过早，但CD19 CAR T细胞至少似乎能够实现持久的疾病和药物缓解。
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