乳铁蛋白-骨桥蛋白复合物：对肠道类器官生物利用度和肠道微生物群调节的见解

Lactoferrin-osteopontin complexes: insights into intestinal organoid bioavailability and gut microbiota modulation

乳铁蛋白（LF）和骨桥蛋白（OPN）是关键的具有免疫调节功能的活性牛奶蛋白，它们对肠道和全身健康有显著益处。我们使用一种模拟人体肠道上皮的高通量三维顶端外翻肠道类器官平台，研究了牛乳LF-OPN可溶性复合物（SC）和复凝聚体（CC）的生物利用度及肠吸收动力学。研究结果表明，与单独的LF和OPN成分相比，SC和CC复合物均表现出细胞摄取能力，但复合并未影响肠道类器官的存活率，即使在长时间暴露后亦如此。此外，基于婴儿粪便微生物群的离体结肠发酵研究表明，LF-OPN复合物显著影响了微生物代谢活动，从而增强了短链脂肪酸（SCFAs）的生成，特别是丁酸水平——这是维持肠道健康的关键代谢物。系统发育分析显示，有益菌家族如脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、多尔氏副拟杆菌（Phocaeicola dorei）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和共生梭菌（Clostridium symbiosum）在复合生物活性物质中显著增加。我们的研究结果表明，LF-OPN复合物在通过微生物群调节进一步优化婴儿营养方面具有巨大潜力。

结果与讨论

开发并表征用于研究牛奶生物活性物质生物利用度的微阵列高通量三维顶端外翻肠道类器官平台

开发微阵列高通量三维肠道类器官平台是实现大规模体外获取人体肠道环境的重要一步。该平台可以同时评估牛奶生物活性物质（如乳铁蛋白-骨桥蛋白复合物，包括SC和CC）的生物利用度和毒性。SC指LF和OPN通过非共价相互作用形成的分子组装体，保持溶解状态而不沉淀；而CC则是通过LF和OPN之间静电相互作用驱动的相分离形成的超分子致密胶体复合物。最近的研究表明，在婴儿消化模型中使用SC和CC形式的牛乳LF和OPN能够显著延缓其蛋白酶解过程，这使得这些蛋白质在胃消化后可能以更完整的结构形式到达肠道。将这些复合形式的LF和OPN作为添加剂加入婴儿配方奶粉中，可能会增强这两种蛋白质的生物利用度，以便于肠道吸收。牛奶蛋白质的这种复杂结构模仿了人乳中蛋白质的自然组织形式，为其提供了额外的抗酶解保护。这种结构完整性不仅延长了关键生物活性成分的存在时间，还确保它们以可能优化婴儿健康和发展功能的形式到达肠道。为了在单个类器官分辨率下研究这些复杂的生物活性化合物，我们成功地从小肠活检中衍生出顶端外翻和基底外翻的人类肠道类器官。调整基底膜提取物（BME）浓度对类器官极性产生了明显影响，较低浓度（0–0.5%）产生顶端外翻类器官，而较高浓度（1.5%）生成基底外翻类器官。这些发现与先前的研究一致，表明细胞外基质成分在确定上皮极性方面至关重要。顶端外翻类器官更适合研究生物利用度和生物活性吸收，因为它们暴露了顶端膜，模仿了体内肠道上皮细胞的自然取向，直接与营养物质和生物活性化合物相互作用。这种取向有助于准确建模营养物质运输、吸收以及与微生物群的相互作用，非常接近体内条件。在本研究中，优化牛乳LF和OPN在不同pH范围内的ζ电位分布为理解它们的复合行为提供了关键见解。LF和OPN的ζ电位分布突显了这些牛奶生物活性物质在不同pH值下的表面电荷行为。LF在酸性pH下显示出正ζ电位，随着pH升高而降低，这与大多数经历离子化的蛋白质行为一致。OPN具有低等电点，因此表现出更为负的ζ电位，表明其可能与带正电荷的分子发生相互作用。LF-OPN复合物在中等酸性pH（约5–5.8）下形成可溶性复合物，并转变为复凝聚体形式，进一步确立了pH在调节这些牛奶蛋白质生物活性形式中的相关性。这一过程还受到诸如化学计量比和离子强度等因素的影响，进一步促成了这些复合物的行为。

LF、OPN及其复合物（SC和CC）对顶端外翻类器官的影响

已建立的顶端外翻类器官被用来评估牛乳LF、牛乳OPN及其复合物对细胞存活率的影响。完整LF、OPN、SC和CC的蛋白含量为1 mg/mL，其中复合物（SC和CC）的LF与OPN化学计量比为4:1，这在人乳的化学计量范围内。接下来，使用之前描述的体外方法模拟婴儿胃肠道消化。在进行细胞毒性测试时，顶端外翻肠道类器官用四种完整和四种消化后的蛋白质化合物处理了8小时和24小时。无底物消化液（S.F.D.）（S.F.D. - 10%）、Triton-X100（0.2%）和未经处理的类器官作为对照。荧光显微镜（Calcein-AM和Ethidium Homodimer-1（EthD-1））结果显示，经完整和消化形式的LF、OPN及其复合物处理后的类器官存活率。最显著的结果是在存在SC和CC的情况下，即使经过24小时处理，类器官存活率仍得以保持，与未经处理的对照组和阳性对照（0.2% Triton X处理）相比。这表明这些牛奶生物活性物质无论是完整还是消化形式都不会引起肠道类器官的毒性，这对于其作为膳食补充剂、婴儿配方奶粉成分或治疗剂的潜在应用而言是一个重要考虑因素。定量分析进一步支持了这些发现，仅在阳性对照中观察到显著的存活率下降，而SC和CC处理则未出现此类效果。双因素方差分析证实了这些发现的统计显著性，强化了LF和OPN单独或组合使用不会损害类器官存活率的结论。

使用自下而上的蛋白质组学分析（LC-MS/MS）

使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行的自下而上的蛋白质组学分析使我们能够详细了解这些生物活性物质如何被类器官吸收。样品中除了牛乳LF和OPN，还鉴定了3000多种源自人类类器官来源的人类蛋白质。在类器官样本中，经LF、SC和CC处理后不同时间段（3、8和24小时）的LF肽段和OPN肽段半定量测量（分别为0.2和1.0 mg/mL），揭示了类器官内各浓度下的吸收动态。有趣的是，LF和OPN肽段在24小时后检测到的数量更高，表明存在时间依赖性吸收机制。然而，CC形式似乎在延长暴露（24小时）后略微提高了LF的吸收水平，特别是在较高浓度（1.0 mg/mL）下。这表明复凝聚体结构可能更好地与肠道上皮表面相互作用，可能增强其吸收和随后的生物利用度。与纯蛋白质（LF和OPN）相比，SC和CC的光谱计数略低，可能是由于复合形式中LF和OPN的相对浓度较低（质量比为4:1，即对于1 mg/mL的复合物，提供0.8 mg/mL的LF和0.2 mg/mL的OPN）。为了验证生物活性吸收，添加了一个基于完整LF的额外对照：在裂解前立即孵育的洗涤对照（0小时），以测量蛋白质粘附在细胞膜上的程度。类器官裂解物中LF肽段数量随孵育时间延长显著增加，表明这些生物活性物质不仅与类器官相互作用，还被内部化，可能在其生理调节中发挥功能性作用。有趣的是，OPN的吸收模式与LF相似，在较晚的时间点（24小时）检测到更高的水平，但在用CC处理类器官时除外。总体而言，OPN的半定量值远低于LF，可能是由于LF和OPN的不同理化特性、其在复合物中的比例差异、与类器官表面的相互作用，以及其序列长度允许在基于质谱的蛋白质组学中检测到的胰蛋白酶肽段数量差异所致。因此，CC形式的OPN吸收结果可能因在这些条件下蛋白质整体检测水平较低而减弱。总的来说，LF-OPN复合物在顶端外翻肠道类器官平台中的生物利用度突显了它们在增强婴儿营养配方中的潜在用途。值得注意的是，CC形式观察到的潜在更高结构稳定性和延迟蛋白酶解对应于改进的吸收动力学，特别是在延长孵育期后LF成分的增强内化。CC形式观察到的改进生物利用度可能归因于其密集堆积的宏观结构架构，促进了更强的分子间相互作用并减少了蛋白酶的可及性。这种结构保护可能使消化后的较大蛋白质片段得以持续存在，从而在上皮界面增强其内化，相较于更易溶解的SC形式。尽管我们的实验条件维持了接近中性的pH和典型的细胞培养稳定离子强度，但未来需要在这些特定条件下进行直接结构表征研究，以确认SC和CC复合物在暴露于肠道类器官期间的完整性和稳定性。此外，即使长时间暴露于完整和消化后的LF-OPN复合物，类器官存活率的保持也突显了其安全性和功能兼容性，这是膳食补充和婴儿营养治疗应用的重要标准。此外，LF和OPN在不同处理条件下的差异吸收表明存在不同的理化相互作用，可能影响各自的功效特征。这一发现为根据个体肠道特征或发育阶段定制个性化营养策略提供了有趣的机会。此外，这些结果为进一步探索特定吸收机制、潜在的受体介导吸收过程和生物活性反应的个体差异奠定了坚实基础。最终，这种深入的理解将有助于战略性配制富含生物活性物质的营养产品，模仿人乳的复杂结构和功能，以优化关键早期发育窗口期间的肠道和全身健康。

离体肠道模型中LF-OPN复合物引起的微生物代谢和微生物群系统发育变化

为了评估牛乳LF-OPN复合物对肠道微生物群的更广泛影响，使用六名婴儿供体的粪便样本进行了24小时的离体结肠发酵实验。在Systemic Intestinal Fermentation Research (SIFR)®高通量生物反应器中使用婴儿粪便样本，可以控制研究微生物群对这些生物活性物质的代谢反应。这些处理显著调节了通过气相色谱火焰离子化检测器（GC-FID）测定的关键微生物代谢输出。小提琴图展示了不同处理下理化参数的显著变化，如pH、气体生产、支链短链脂肪酸（BCFAs）和总短链脂肪酸（SCFA）水平。值得注意的是，LF和OPN，尤其是其CC形式，导致了SCFA产量的增加，这与对肠道健康的有益影响相关。这一发现表明，复凝聚体可能增强微生物发酵过程，从而改善肠道健康结果。乙酸和丙酸水平也受到影响，LF和OPN处理样本中的生产水平相似，表明这些生物活性物质正向调节肠道微生物群活动。SCFAs对维持肠道健康至关重要，其中丁酸尤其在增强肠道屏障功能和发挥抗炎作用方面扮演关键角色。观察到的SCFA产量增加表明，LF和OPN的复合形式可能具有益生元样效应，促进生成这些重要代谢物的有益菌的生长。然而，戊酸和乳酸水平与对照条件相比没有显著差异。丁酸浓度在不同供体间表现出一定程度的变异性，表明微生物对这些生物活性物质的代谢反应可能是个性化的。这一点进一步得到了主成分分析（PCA）和堆叠条形图的支持，显示每个婴儿供体的独特微生物群落结构。这些供体间的差异可能归因于个体间微生物组成的固有变异性，突显了理解肠道微生物群交互作用时个性化方法的重要性。细菌细胞密度分析通过定量浅层鸟枪测序揭示，这些处理也显著影响了微生物群体，LF和OPN复合形式导致细菌生长增加，与对照相比显著。这表明，类似于LF和OPN处理，这些生物活性复合物不仅影响微生物代谢，还促进特定微生物群落的增殖。通过测序进行的系统发育组成和细菌细胞密度分析进一步证明了LF和OPN及其复合物对微生物群组成的影响。观察到微生物群落结构的显著变化，特别是在双歧杆菌科、毛螺菌科、拟杆菌科和里肯氏菌科。这些变化与LF和OPN已知的益生元效应一致，此前研究表明它们能够增强有益菌（如双歧杆菌）的生长。热图显示了微生物分类丰度，进一步证明了这些生物活性物质对肠道微生物群的选择性影响。LF和OPN，无论是可溶形式还是复凝聚体形式，都对拟杆菌门和厚壁菌门中关键细菌种类的丰度产生了不同的影响。深入分析处理效应证实，用LF和OPN基产品处理后，丙酸生成与脆弱拟杆菌、多尔氏副拟杆菌和副拟杆菌属的特定增加有关，所有这些都被认为是丙酸生成者。副拟杆菌属丰度的增加不仅是一种琥珀酸生成者（丙酸的已知前体），而且已被证明具有广泛的健康益处。这些分类群与各种健康促进效应相关。例如，脆弱拟杆菌以其抗炎特性著称，已证明能够减少全身炎症并促进调节性T细胞发育，可能缓解诸如炎症性肠病等病症，甚至神经发育障碍。多尔氏副拟杆菌（以前被归类为多尔氏拟杆菌）也与减少全身炎症和对心血管疾病和某些代谢综合征的保护作用有关。同样，副拟杆菌属除了在生成琥珀酸和丙酸方面的作用外，还与宿主免疫系统的调节有关，显示出感染抵抗、免疫调节和抗癌特性的潜在益处，包括在结直肠癌发展中的保护作用。总之，这些发现加强了LF和OPN复合形式生物活性处理能够促进丙酸生成的假说，下游效益涉及炎症调节、感染抵抗和潜在癌症预防。观察到的LF和OPN基产品显著的丁酸生成可能是由于一系列丁酸生成菌的刺激，尤其是毛螺菌科和瘤胃球菌科成员。特别值得一提的是，梭状芽孢杆菌在OPN（0.72）和SC（0.47）处理下均有增加。这种物种是已知的丁酸生成者，在膳食纤维和复杂多糖的发酵中起着关键作用。此外，其他丁酸生成者如瘤胃球菌科成员也在由复合形式处理引发的微生物变化中占据突出地位。毛螺菌科家族在丁酸生成中也起着关键作用。此家族中其他分类群的增加进一步支持了丁酸合成可能增加的假设。这些细菌参与不可消化碳水化合物的发酵，是人类结肠中的主要丁酸生成者。总的来说，LF-OPN复合物在离体肠道发酵模型中展现出的微生物代谢和群落组成的显著调制突出了它们重塑婴儿肠道微生物群的潜力。值得注意的是，LF-OPN复合物处理后SCFA（特别是乙酸、丙酸和丁酸）产量的显著增加，突显了它们的益生元样活性。这些代谢物通过强化屏障完整性、调节免疫功能和减少炎症在肠道健康中发挥关键作用。

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