衰老相关miR-23b-3p在间充质基质细胞外囊泡中的表达变化影响TGFBR3信号传导

Aging-related changes of miR-23b-3p expression in extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells affect TGFBR3 signaling

研究表明，细胞外囊泡（EVs）携带如微小RNA（miRNAs）和细胞因子等生物介质，在调节受体组织中起着关键作用，并被认为是细胞治疗的关键机制。然而，发现供体细胞的细胞老化显著影响这些参与细胞间通讯的介质的表达谱。在这项研究中，我们确定了miR-23b-3p作为通过靶向TGFBR3调控干性相关基因的调节因子，其在年轻和老年供体的间充质干细胞（MSCs）中表达不同。在老年MSCs中，人类MIR23B启动子区域的高甲基化导致其下调。用去甲基化剂丙戊酸（VPA）处理可恢复miR-23b-3p的表达，并促进其融入EVs。我们的研究结果表明，MSCs的老化会改变EVs的miRNA组成，可能破坏细胞间通讯，并显著影响细胞移植的疗效。为解决这一问题，诱导去甲基化可能成为提高MSCs治疗效果的一种有前景的策略。

引言

间充质干细胞（MSCs）是存在于多种组织中的多能基质细胞，包括骨髓。它们通过分泌生物活性因子如细胞因子、生长因子和细胞外囊泡来维持组织稳态，并调节免疫反应和促进组织修复。利用这些特性，基于MSC的细胞移植疗法在过去十年中在全球范围内迅速扩展，显示出在治疗一系列炎症和退行性疾病方面的潜力[1]。另一方面，MSCs受到细胞老化和衰老的影响，导致功能减弱和疗效降低[2,3,4,5]。细胞老化在MSCs中引起转录变化，由氧化应激和表观遗传修饰（包括DNA甲基化和组蛋白修饰）驱动[6,7,8]。这些表观遗传变化扰乱了维持干性和再生能力至关重要的基因表达模式。值得注意的是，衰老会影响MSCs分泌的EVs的组成，这些EVs作为载体参与远处细胞的转录后调节[9,10,11]。EVs中miRNA含量的变化可以损害细胞间通讯，影响干细胞维持、免疫反应、细胞外基质表达和血管生成等过程[12,13,14,15,16]。miRNA在EVs中的年龄相关表达变化可以改变细胞间通讯，潜在影响各种生理过程[17,18,19]。鉴于MSCs在维持造血功能、上皮细胞功能和血管完整性方面的重要作用[20,21]，阐明EVs中与年龄相关的miRNA表达变化对于理解与年龄相关的生理变化机制至关重要。研究这些与年龄相关的改变及其在老年MSCs中的信号通路不仅能够增强基于MSC的移植疗法的效果，还能提供有关人类衰老机制的宝贵见解。

在这项研究中，我们证明了miR-23b-3p是一种存在于EVs中的受老化影响的miRNA，在老年细胞中表达水平下降，导致其靶基因TGFBR3上调。我们还发现，MIR23B基因上游区域的多个CpG位点，并显示在衰老模型细胞中用去甲基化剂丙戊酸（VPA）处理可以恢复EVs中的miR-23b-3p水平。

材料和方法

人体材料研究的伦理考量

近畿大学医学部机构审查委员会批准了人体组织采集的方案，批准的研究项目编号为R03-041。组织样本是从近畿大学医院接受脊柱手术的患者中收集的，并获得了知情同意。所有方法均按照相关指南和规定执行。

动物研究的伦理考量

所有涉及动物处理、护理、手术和牺牲的程序均由近畿大学机构动物护理和使用委员会批准，批准的研究项目编号为KAME2022-062，并按照机构指南和规定执行。所有方法均按照ARRIVE指南报告。

小鼠骨髓间充质基质细胞（BMMSCs）的制备

本研究中使用的所有小鼠均购自CLEA Japan公司（大阪，日本）。小鼠在符合机构和国际指南的受控条件下饲养和维护。三到四周龄的雄性C57BL/6J（B6）小鼠作为年轻模型，而20至24个月龄的雄性B6小鼠作为老年模型。小鼠BMMSCs按先前描述的方法分离。简而言之，清洗后的股骨和胫骨被切成小块，并用0.1%胶原酶II型（Wako，东京，日本）处理15分钟。含有BMMSCs的单细胞悬液被收集，用PBS洗涤两次，并接种在细胞培养皿（Sumilon，住友贝克力有限公司，东京，日本）中，在补充有200 mM L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（CORNING，洛厄尔，美国）的αMEM（赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，美国）中，置于5% CO2和5% O2条件下37°C培养。第二天更换培养基以去除死细胞和碎片。经过10天的培养，用TrypLE（赛默飞世尔科技）分离BMMSCs进行进一步实验。实验中使用了不超过三代的BMMSCs。

人BMMSCs的制备和培养

本研究使用的标本是在脊柱和膝关节手术过程中收集的骨髓液体副产品。所有样本均在获得患者知情同意后取得，除标准手术技术外未进行额外侵入性操作以收集样本。排除感染、恶性肿瘤或慢性免疫疾病（如系统性红斑狼疮或类风湿性关节炎）的患者。样本分为两组：年轻组（25-44岁）和老年组（65-95岁）。

从接受手术的患者中收集4毫升骨髓血液。将骨髓血液与含10% FCS的DMEM混合，接种于100毫米培养皿中，37°C、5% CO₂和5% O₂条件下培养。第二天更换培养基以去除红细胞和其他漂浮血细胞，细胞培养10天，每3天更换一次培养基。

细胞外囊泡（EVs）的收集和纯化

对于每个实验，准备四份100毫米培养皿中的亚汇合MSCs。将培养基替换为添加了无EV牛血清的DMEM，该牛血清通过超离心处理去除了EVs，并将细胞孵育48小时。孵育后，收集所有培养基，4°C下以10,000 g离心10分钟，然后通过0.45 µm滤器过滤。将上清液转移到40 PA管（Eppendorf Himac Technologies Co., Ltd., 茨木市，日本）中进行超离心。将试管放置在Himac CP80NX超离心机（Eppendorf Himac Technologies Co., Ltd.）中，在4°C下以130,000 g离心70分钟。去除上清液后，将所得沉淀用0.1% PVA-PBS洗涤，转移到3.5 mL开口厚壁聚碳酸酯管（贝克曼库尔特，布雷亚，加利福尼亚州，美国），并在4°C下再次以130,000 g离心70分钟，使用TL-100（贝克曼库尔特）。纯化的EVs以20 µg/mL的浓度加入细胞，或用于总RNA提取，随后用于miRNA阵列和RT-PCR实验。

miRNA微阵列分析

使用TRIzol试剂（赛默飞世尔科技）提取的总RNA和Affymetrics GeneChip miRNA 4.0阵列（赛默飞世尔科技）平台进行微阵列基因表达分析，并使用Affymetrix Transcriptome Analysis Console软件（赛默飞世尔科技）进行数据分析。

定量RT-PCR（qRT-PCR）

使用TRI Reagent®（分子研究中心公司，辛辛那提，俄亥俄州，美国）从MSCs中提取总RNA，并用PrimeScript® RT Master Mix Kit（宝生物工程公司，滋贺县，日本）进行反转录。使用Perfect Real-Time SYBR Green II（宝生物工程公司）和补充表S1中列出的特异性引物进行RT-PCR。为避免扩增污染的基因组DNA，所有引物设计至少跨越一个内含子。使用Mir-X™ miRNA定量系统对miRNAs进行定量RT-PCR。从细胞或EVs中提取的总RNA经Mir-X™ miRNA第一链合成试剂盒（宝生物工程公司）进行反转录。细胞中miRNA的相对表达通过将miR-23b-3p的表达水平标准化到同一样本中的GAPDH进行评估，而EVs中miRNA的表达则标准化到miR-451a-5p。

各miRNA的特异性5′引物如下：

• mmu/hsa-miR-23b-3p: ATCACATTGCCAGGGATTACCAC,
• hsa-miR-451a-5p: AAACCGTTACCATTACTGAGTT,
• mmu-miR-451a-5p: AAACCGTTACCATTACTGAGTT.

使用miRNA模拟物或siRNA处理原代MSCs

使用Lipofectamine® RNAiMAX（赛默飞世尔科技）按照制造商说明将原代MSCs转染miRNA模拟物或siRNA。由GeneDesign公司（大阪，日本）合成的mmu/hsa-miR-23b-3p miRNA模拟物序列如下：AUCACAUUGCCAGGGAUUACC/AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC。来自秀丽隐杆线虫的cel-miR-67-3p序列：UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA用作对照miRNA。阻断Tgfbr3的siRNA由Japan Bio Services Co., LTD.（埼玉县，日本）合成，序列为：

正义序列-CUU AAG AUA GCA AGA AAU AdTdT 和反义序列-UAU UUC UUG CUA UCU UAA GdTdT。转染48小时后收集细胞用于RT-PCR、WB或蛋白质组学分析。

蛋白质组分析样品制备

使用RIPA缓冲液提取蛋白质并用BCA测定法测定浓度。使用胰蛋白酶以1:50的比例在37°C下消化过夜。所得肽段用C18柱脱盐并用真空离心干燥。

色谱和质谱分析

肽混合物在含有0.1%甲酸的溶液中重新溶解，并使用Vanquish Neo UHPLC系统（赛默飞世尔科技）配备Aurora Ultimator柱（IonOpticks，菲茨罗伊，维多利亚，澳大利亚）进行液相色谱分析。质谱分析使用Orbitrap Exploris 480（赛默飞世尔科技）进行。使用Thermo Proteome Discoverer ver 2.5.0.400处理质谱数据。原始文件使用SEQUEST算法针对UniProt人类数据库进行搜索。肽和蛋白质鉴定在肽和蛋白质水平上的错误发现率（FDR）<1%进行过滤。使用无标签定量（LFQ）评估样品中蛋白质的相对丰度。

亚硫酸氢盐处理和去甲基化序列特异性qPCR

从每位供体获取的原代MSCs取样，并在细胞校正当天提取基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理。按照制造商说明，使用EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒（Qiagen，希尔登，德国）对每个样本的200 ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理。处理后的亚硫酸氢盐DNA立即用于第一轮PCR。亚硫酸氢盐PCR使用EpiTaq HS（宝生物工程）以1/10的亚硫酸氢盐转化DNA为模板进行，使用补充图4中列出的引物，并根据制造商协议扩增40个循环。使用TB Green Premix Ex Taq（宝生物工程）和补充图S3中列出的引物进行去甲基化序列的定量。

老年MSCs的去甲基化处理

当从老年供体制备的MSCs达到70%汇合时，用1 mM DNA去甲基化诱导剂丙戊酸（VPA）[22]和5 ng/uL FGF2处理72小时。通过检测已知在衰老过程中受甲ylation负调控的代表性基因ELOVL2的表达变化来评估去甲基化处理后的基因表达变化。

统计分析

所有统计分析均使用JMP Pro 18（SAS Institute Inc., 东京，日本）进行。所有动物实验和体外实验均独立重复三次。对于三个或更多组之间的比较，应用Tukey的诚实显著差异（HSD）检验。对于两个独立组之间的比较，使用Student's t检验。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

年轻和老年MSCs的EVs显示不同的miRNA表达谱

这项研究旨在检查衰老如何改变EVs中的miRNAs及其对BMMSCs调控的细胞间通讯的影响。

分别从3周大的年轻小鼠（Yg-MSC）和2年大的老年小鼠（Ag-MSC）建立的MSCs中收集EVs，并通过微阵列分析其中包含的miRNAs。将1.5 × 10^7个MSCs在80 mL补充有无EV的10%胎牛血清（FCS，NICHIREI BIOSCIENCES INC., 东京，日本）的培养基中培养48小时，然后通过超离心收集MSC衍生的EVs。从EVs中提取的总RNA进行的miRNA阵列分析显示，Yg-MSCs和Ag-MSCs衍生的EVs中几种miRNAs的表达差异（图1A，表1）。在Yg-MSCs和Ag-MSCs之间表现出差异表达的miRNAs中，25种表现出大于2的log2倍变化。其中，mmu-miR-190a-3p、mmu-let7i-5p、mmu-miR-5100、mmu-miR-365-2-5p、mmu-miR-23b-3p、mmu-miR-448和mmu-miR-877-5p在人和小鼠中均保守。对于mmu-let7i-5p、mmu-miR-365-2-5p、mmu-miR-448和mmu-miR-23b-3p，使用从小鼠和人类原代BMMSCs中提取的总RNA进行的RT-PCR验证结果与微阵列分析一致（图S1）。我们决定对这四个miRNAs中表达最高的mmu-miR-23b-3p进行更详细分析（图1B）。为了确认衰老引起的mmu-miR-23b-3p下调也发生在骨髓组织中的MSCs中，使用FACS从小鼠骨髓中收集CD45-/Ter119-/PDGFRα+/Sca1+部分，然后进行PCR分析。在从三只年轻小鼠和三只老年小鼠中分离的MSCs的比较分析中，老年MSCs中mmu-miR-23b-3p的表达水平降至年轻MSCs的不到20%（图1C）。重要的是，这种随年龄增长的miR-23b-3p减少也在从10名不同供体中制备的人类原代MSCs中观察到（图1D和E）。在这项研究中，GAPDH被用作内源性对照以标准化人类样本中qPCR结果的miR-23b-3p表达，确保数据一致可靠。由于有报道称U6在不同患者状况下的表达变异可能会损害数据准确性[23]，因此未使用常用的miRNA量化参考U6。在小鼠模型中，我们确认无论使用GAPDH还是U6作为内源性对照进行半定量分析，年轻和老年MSCs之间miR-23b-3p的差异表达保持一致（图S2）。这些结果表明，miR-23b-3p是一种在衰老过程中表达下调的miRNA，并且这种减少反映在其产生的EVs中。

图1

MSCs和其EVs中的miR23b-3p表达因供体年龄增长而受到抑制。（A）通过miRNA阵列分析显示年轻小鼠MSCs（Yg-MSC）和老年小鼠MSCs（Ag-MSCs）中EVs的miRNA差异表达。（B）通过RT-PCR分析Yg-MSCs和Ag-MSCs产生的EVs中mmu-miR-23b-3p的表达水平。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（C）年轻和老年小鼠制备的原代MSCs中mmu-miR-23b-3p的胞质表达比较。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（D）通过FACS从小鼠骨髓中提取MSCs作为CD45-/Ter119-/PDGFRα+/Sca1+部分，并比较mmu-miR-23b-3p的表达。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（E）老年供体制备的原代MSCs中hsa-miR-23b-3p的表达。

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表1 青年和老年小鼠来源MSCs的EVs中miRNAs的微阵列分析

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miR-23b-3p参与Tgfbr3基因表达的抑制调控

为研究衰老引起的miR-23b-3p表达水平变化对MSCs周围细胞间通讯的影响，我们将mmu-miR-23b-3p模拟物转染到原代Ag-MSCs，并进行了鸟枪法蛋白质组分析。

为识别miR-23b-3p的靶基因，我们比较了转染cel-miR-67-3p作为对照miRNA的细胞与转染mmu-miR-23b-3p的细胞，并列出了表达减少了超过60%的蛋白质（表S3）。在满足此标准的70种蛋白质中，Tgfbr3被两种不同的miRNA靶预测工具TargetScan和miRDB确定为mmu-miR-23b-3p和hsa-miR-23b-3p的靶蛋白。

在体外验证了miR-23b-3p对小鼠和人类MSCs中Tgfbr3表达的抑制作用（图2A）。此外，用年轻BMMSCs衍生的EVs处理的老年MSCs中Tgfbr3表达减少了大约40%（图2B）。而在老年小鼠骨髓中分离的CD45-/Ter119-/PDGFRα+/Sca1+体外BMMSCs中Tgfbr3表达上调（图2C），以及老年供体来源的人类原代MSCs中Tgfbr3表达增加（图2D）。

图2

mmu/hsa-miR-23b-3p在老年供体MSCs中靶向TGFBR3。（A）将mmu-miR-23b-3p模拟RNA转染到MSCs中并观察Tgfbr3基因表达的变化。左：Ag-MSCs中模拟RNA转染引起的Tgfbr3表达变化。右：在老年供体MSCs中模拟RNA转染引起的Tgfbr3表达变化。秀丽隐杆线虫miRNA cel-67-3p用作对照。不同字母表示在P < 0.05水平上观察到显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（B）将Yg-MSCs衍生的EVs加入Ag-MSCs后Tgfbr3的表达。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（C）在老年小鼠骨髓中分离的CD45-/Ter119-/PDGFRα+/Sca1+ MSC部分中观察到的Tgfbr3表达升高。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（D）在老年供体来源的原代MSCs中发现的Tgfbr3表达增加。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。

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Tgfbr3调控MSCs中涉及增殖和转移的基因

通过蛋白质组分析，我们鉴定了在转染miR-23b-3p后上调的蛋白质，并研究了这些蛋白质中TGFBR3的潜在下游靶标（表S4）。蛋白质组分析显示，转染mmu-miR-23b-3p模拟RNA的MSCs中NAT10、IFI35、PSPC1、CUL1和LY6A的表达水平升高——这些基因与细胞增殖、干性和转移的调控有关。此外，Ag-MSCs中通过siRNA介导的Tgfbr3敲低导致NAT10、IFI35、PSPC1和LY6A的上调，表明Tgfbr3的抑制有助于这些基因表达的增加（图3A和B）。

图3

Tgfbr3调控MSCs的增殖、迁移和干性。（A）转染mmu-miR-23b-3p模拟RNA到Ag-MSCs中后上调的前15种蛋白质列表。星号表示在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（B）Ag-MSCs中转染靶向Tgfbr3的siRNA（siTgfbr3）后增殖、转移和干性相关基因的表达增加。星号表示在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。

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使用去甲基化剂部分重编程Ag-MSCs可恢复miR-23b-3p的表达

先前的研究已确定了人类MIR23B基因启动子区域内的CpG岛，表明这些位点的DNA甲基化在hsa-miR-23b-3p表达的调控中起作用[24,25,47]。正如本研究所示，供体年龄影响miR-23b-3p的表达水平。为研究这种年龄相关差异是否与MIR23B启动子CpG岛的甲基化变化相关，我们进行了亚硫酸氢盐定量PCR（qPCR）。从26-44岁供体获得的MSCs被指定为Yg-MSCs，而从74-83岁供体获得的MSCs被指定为Ag-MSCs。DNA是从不超过两周培养且未传代的细胞中提取的。亚硫酸氢盐处理后，初始引物设计扩增不含CpG位点的区域，以确保亚硫酸氢盐转化DNA的无偏扩增。随后，使用涵盖MIR23B启动子内CpG位点的引物进行qPCR（图S3）。结果显示，老年组的PCR Ct值显著增加，表明这些样本中CpG区域的甲基化程度更高（图4A）。

图4

通过老年供体MSCs中的去甲基化上调hsa-miR-23b-3p。（A）人类MIR23B基因启动子区域的亚硫酸氢盐qPCR分析。引物专门设计靶向去甲基化的CpG序列，只有在序列去甲基化时才能发生PCR扩增。Y轴表示Ct值，较高的Ct值表示较低的去甲基化程度。条形上方的点代表个别供体的Ct值。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。（B）通过VPA + FGF2处理MSCs老年供体引起的hsa-miR-23b-3p和ELOVL2表达升高。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。（C）在经去甲基化处理的人类MSCs中分离的EVs中检测到更高的hsa-miR-23b-3p含量。星号表示比较组之间在p < 0.05水平上的显著差异。每个条形代表三次独立实验的平均值±标准差。

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我们调查了小分子化合物处理是否可以恢复老年供体MSCs中miR-23b-3p的表达。当用VPA和FGF2处理老年供体的MSCs时，hsa-miR-23b-3p的表达增加了约3.5倍，与未处理对照组相比（图4B）。此外，在这些细胞中，随着衰老过程中受甲基化负调控的代表性基因Elovl2的表达也有所升高（图4B）。重要的是，通过VPA和FGF2处理引起的miR-23b-3p的升高也反映在EVs内的miRNA组成中。从经VPA + FGF2处理的MSCs收集的EVs中包含的hsa-miR-23b-3p比未处理细胞高出六倍（图4C）。

讨论

MSCs广泛分布于全身，并在组织完整性中起着关键作用[20,26,27]。众所周知，MSCs通过EV介导的通讯调节其周围细胞的基因表达[10,28]。因此，MSCs中的衰老相关变化可能会通过改变EV-miRNA表达模式破坏周围组织和邻近干细胞（包括MSC本身）的完整性[29]。在这项研究中，我们发现从小鼠和供体的骨髓MSCs中分离出的EVs中miR-23b-3p水平降低。

为确认miR-23b-3p在MSCs中的功能，我们将mmu-miR-23b-3p模拟物转染到老年MSCs中，并通过蛋白质组分析发现TGFBR3是mmu-和hsa-miR-23b-3p的潜在靶标。

TGF-β信号传导调节全身各种组织的稳态，并参与MSCs的增殖和分化调控。TGFβ在MSCs衰老或衰老表型表达中的作用仍存在争议[30]。在个体生物层面，TGFβ信号传导似乎通常与衰老特征的表达呈正相关。例如，老年小鼠骨骼肌中TGFβ表达和Smad3磷酸化增加[31]。此外，在老年小鼠和人类中观察到血清TGFβ水平升高[32]。TGFβ1被认为通过阻断肌肉再生和诱导组织纤维化，从而导致人类和小鼠肌肉萎缩[33]。跨年龄段肌肉活检的比较分析显示，老年人群肌肉细胞中TGFβ信号传导活动显著更高[34]。同样在骨髓来源的MSCs中，TGFβ已被报道以剂量依赖方式增加衰老标志物的表达水平，包括p16Ink4a和4-羟基壬烯醛（4-HNE）亚单位，以及SA-β-gal活性和线粒体ROS产生[35]。在TGFβ表面受体中，III型受体（TGFBR3），也称为betaglycan，是必不可少的，也是介导TGFβ信号传导最丰富的受体[36,37]。Betaglycan与抑制素和II型激活素受体形成稳定的复合物，从而隔离激活素II型受体，减少其传播激活素信号的能力[38]。尽管关于TGFBR3在干性中的功能了解不多，Cook等人报告称，MSCs中betaglycan的缺失足以增强增殖和迁移，并通过刺激Wnt5a的表达完全阻断MSC-成骨细胞分化程序，Wnt5a在干性中起重要作用[39]。Nishida等人报告称，肾细胞癌中TGFBR3的抑制增强了转移能力[40]。虽然与衰老的关系尚不清楚，但已经显示TGFBR3的基因表达随着光老化呈现上升趋势[41]。蛋白质组分析还显示，转染miR-23b-3p模拟物的MSCs中Nat10[42]、Ifi35[43]、Pspc1[44,45]和Ly6A（Sca1）[46]的表达水平升高，这些都与细胞增殖、迁移和可塑性有关。这些发现表明，miR-23b-3p的转染增强了MSCs的干细胞特性，支持的结果是Cdkn2a表达在MSCs中因miR-23b-3p转染而下调。

重要的是，老年小鼠MSCs中通过siRNA介导的Tgfbr3抑制复制了miR-23b-3p过表达所观察到的基因表达变化，至少在本研究分析的标志性基因中是如此。然而，当老年MSCs用年轻MSCs衍生的EVs处理时，仅Nat10、Cul1和Cdkn2A表现出显著上调，而Pspc1、Sca1和Ifi35没有明显变化（图S4）。这种差异可能是由于EVs的复杂组成，其包含多种细胞因子和microRNAs，可能导致与针对单一基因的siRNA相比，效果部分或不一致。这是本研究的一个重要限制，也是其他基于EV的治疗方法的限制。对于临床应用，实现更选择性和一致的结果是至关重要的。因此，进一步研究EV生产细胞的生理状态和优化培养条件对于提高基于EV的疗法的特异性和功效至关重要。

先前的研究已在人类MIR23B基因启动子区域识别出CpG岛，表明其表达通过DNA甲基化受到表观遗传调控[24,25,47]。在此基础上，我们假设去甲基化剂处理可以恢复老年MSCs中观察到的miR-23b-3p水平下降。与我们的假设一致，我们发现，用去甲基化剂丙戊酸（VPA）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）处理后，老年MSCs中受抑制的miR-23b-3p表达得以恢复。此外，再表达的miR-23b-3p成功地整合到这些去甲基化MSCs产生的EVs中。这些结果表明，即使老年MSCs也可以通过表观遗传重编程表达miR-23b-3p，从而在miR-23b-3p介导的基因调控网络中发挥积极作用。鉴于miR-23b-3p调控与MSCs干性相关的信号级联，通过化学去甲基化诱导miR-23b-3p表达可能是维持或恢复老年组织中干细胞样特性的一种有效策略。已有实验证明，通过旁分泌因子的转移可以改善或恢复受体细胞的功能：Hung等人报告了共培养年轻MSCs和老年MSCs的结果[48]。此外，类似于我们的研究，也有报道称MSCs EVs中表达的miR-23b-3p抑制与衰老相关的炎症反应[28]。这些发现支持了含有miR-23b-3p的MSCs EVs在治疗衰老相关特征方面的潜力。

MSCs因其产生大量EVs的能力而广为人知，许多治疗策略基于这一特性开发。为确保此类治疗的可靠性，必须考虑封装在EVs中的miRNAs的数量及其传输效率。值得注意的是，先前的研究报告称，根据细胞类型，EVs中包含的miRNA量可能极低，仅有微量不足以产生有意义的功能效应[49]。这一观察强调了一个必须谨慎处理的重要限制。在本研究中，我们展示了MSCs中miR-23b-3p的表达水平根据供体年龄而有所不同。为准确预测细胞或EVs的治疗潜力并实现稳定和安全的临床应用，需要进一步研究以阐明细胞状态、EVs的分子组成及其传递效率。

总之，我们证明了EVs中miR-23b-3p的表达随供体年龄的增长而下降。TGFBR3被确定为miR-23b-3p的关键靶标，其抑制导致MSCs干性特征相关基因的上调。这些发现表明，EV衍生的miR-23b-3p至少可作为预测MSCs治疗效果的生物标记物。此外，我们发现年龄相关的miR-23b-3p表达下降可以通过去甲基化处理部分逆转，突显了开发新细胞处理策略以增强基于MSCs疗法性能的潜力。尽管仍存在一些挑战，包括EVs中表达的miRNAs多样性及miRNA拷贝数、不同类型细胞/组织EVs的传递效率以及去甲基化剂的毒性，仔细考虑这些因素可能有助于开发更鲁棒有效的辅助技术用于细胞治疗。

(全文结束)