马来西亚癌症患者肠道微生物群特征研究

Characterisation of gut microbiota in Malaysian cancer patients using V3-V4 region of 16S rRNA gene sequencing

近期研究表明，肠道微生物群的变化可能与癌症的发生有关。然而，由于研究结果存在矛盾，理解肠道微生物失调在癌症中的作用仍然具有挑战性，尤其是在东南亚等代表性不足的人群中。为了填补这一空白，我们分析了65份粪便样本的肠道微生物群多样性和组成，其中包括48名患有不同类型癌症的患者和17名健康对照者。患者被分为四组：有症状且接受治疗、无症状且接受治疗、无症状且未接受治疗以及健康对照组。提取基因组DNA后，对16S rRNA基因的V3-V4区域进行了测序。我们的研究结果显示，癌症患者与对照组之间的α多样性存在显著差异（p ≤ 0.05）。在接受治疗的无症状患者中，α多样性略低于未接受治疗的患者，但这种差异不显著（p = 0.06）。我们鉴定了13个在患者组和对照组之间丰度差异超过20%的菌属。在接受治疗的无症状患者和未接受治疗的患者中，肠球菌属显著富集，而普雷沃氏菌属、粪杆菌属、短波单胞菌属和假单胞菌属则显著减少。有症状的患者中肠球菌属和葡萄球菌属水平较高，而瘤胃球菌属在无症状患者中富集。这些结果突显了癌症患者与健康个体之间肠道微生物群组成的显著差异，尤其是在症状患者中，肠球菌属、普雷沃氏菌属和粪杆菌属可能是潜在的生物标志物。我们的研究表明，癌症治疗可能不会显著改变癌症患者的肠道微生物群特征，但仍需进一步研究以全面理解这些发现的意义。

引言

人类肠道微生物群是一个高度多样化和动态的微生物群落，包括细菌、古细菌、真菌、真核病毒和噬菌体，它们共同存在于一个复杂的生态系统中。肠道微生物群主要由细菌组成，执行维持身体稳定的重要生理功能，如免疫调节、营养代谢和抵御病原体。每个人的肠道微生物群都是独特的，并受饮食、药物使用、生活方式、遗传和环境条件等因素的影响。最近的研究表明，肠道微生物群失衡（即失调）与多种疾病的发展有关，包括癌症。癌症因其新发病例数量的增加而日益令人担忧。2022年，全球因癌症死亡人数达到970万。高通量测序技术的进步使研究人员能够研究肠道微生物群与各种疾病（包括癌症）之间的联系。研究发现，癌症患者的肠道微生物群组成与健康个体不同。观察到癌症患者通常具有较低的微生物多样性，这与不良后果相关，例如炎症加剧、免疫反应减弱和代谢受损。这些因素可能导致癌症进展和治疗效果不佳。此外，癌症治疗方法如免疫疗法、化疗和靶向治疗可能影响肠道微生物的组成和多样性。

肠道微生物群与不同类型的癌症有关。在结直肠癌中，患者通常表现出特定的微生物模式。这些模式包括促炎性和潜在致癌细菌如具核梭杆菌、大肠杆菌和脆弱拟杆菌的过表达，以及有益微生物如双歧杆菌和乳酸杆菌的减少。一些研究显示，肠道微生物群也可能受到肠道以外疾病的影晌。几项研究表明，在癌症中导致肠道微生物群失调的机制存在不一致的结果。因此，研究癌症患者的肠道微生物群具有重要意义，因为它在理解癌症发展、进展、治疗反应和潜在的新治疗策略方面发挥关键作用。然而，关于马来西亚癌症患者肠道微生物群的研究有限，现有研究主要集中于西方和东亚人群，限制了研究结果在其他种族和地理群体中的普遍适用性。鉴于马来西亚癌症发病率的上升，调查该特定人口中肠道微生物群在癌症中的作用至关重要。本研究旨在检查马来西亚癌症患者的肠道微生物群多样性和组成，并与健康对照组进行比较。我们将介绍马来西亚癌症患者的肠道微生物群特征，并探讨与癌症相关的潜在微生物生物标志物和失调现象。我们希望通过先进的宏基因组测序技术深入了解马来西亚背景下肠道微生物群与癌症之间的复杂相互作用。这可能会导致基于微生物群的个性化干预措施的开发和新治疗策略的识别。

材料与方法

伦理批准和知情同意

研究获得了马来亚大学医学中心（UMMC）医学伦理委员会的批准（MREC ID No. 2019528-7454）。所有方法均符合UMMC医学伦理委员会批准的指南和规定。在研究开始之前，参与者收到了关于研究目的和程序的详细信息。他们被告知所使用的方法没有固有风险，并在整个研究过程中承诺保密和匿名。参与是自愿的，参与者有权退出研究而不承担任何后果。知情同意通过书面签名获得，对于文盲参与者，则通过口头确认和指纹确认。对于16岁以下的参与者，知情同意由父母或法定监护人签署。

研究人群

一般而言，样本收集和处理的详细信息已在其他文献中呈现。简而言之，使用方便抽样法从马来亚大学医学中心（UMMC）肿瘤科招募了53名患有各种恶性肿瘤的癌症患者。符合条件的患者必须至少1岁，确诊癌症，并提供书面同意。患者要么是新诊断的，要么是在招募时正在接受积极治疗，并且在过去一个月内未使用抗生素。不符合这些标准的患者被排除在研究之外。无法获取数据的患者被排除在外。患者被诊断出十种不同的癌症类型，根据疾病本体和肿瘤的主要部位分类。十四名患者出现胃肠道（GI）症状，定义为一种或多种症状，如腹泻、恶心、呕吐和腹痛。这些患者经过调整用于下游分析以消除偏倚，将其分组为有症状或无症状。从医疗记录中获取人口统计数据，包括年龄、性别、个人识别信息、诊断和癌症治疗日期。此外，包括17名健康的马来西亚个体作为健康对照组。这些个体作为健康肠道微生物群比较的基线。假设他们具有相似的饮食和生活习惯，部分控制了环境对肠道微生物群的影响。

样本收集、DNA提取和16S核糖体RNA（rRNA）基因测序

新鲜粪便样本收集在无菌螺口容器中，并立即在-80°C下储存以备DNA提取。使用FavorPrep™粪便DNA分离迷你试剂盒（Favorgen®，台湾）按照制造商的方案通过珠击提取法从粪便样本中提取基因组DNA。使用分光光度计（NanoDrop Technologies，美国）测量提取的DNA浓度和质量，并在-20°C下储存直至进一步处理。

使用类似于Siti Farah Norasyikeen等人描述的流程扩增提取的基因组DNA中16S核糖体RNA（rRNA）基因的V3-V4区域。简而言之，正向引物341F（5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAC CTA CGG GNG GCW GCA G-3’）和反向引物785R（5’-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’），包含Illumina适配器超悬核苷酸序列（正向超悬：（5’ TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG-[位点特异性序列]）和反向超悬：（5’ GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-[位点特异性序列]）），用于扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区域的460 bp片段。

样品库使用KAPA HiFi HotStart构建，并在莫纳什大学马来西亚基因组平台进行Illumina Miseq测序。条形码PCR扩增子按等摩尔比例混合进行2×250 bp配对末端测序，插入大小为450 bp，并用AMP XP磁珠（Beckman Coulter，美国）纯化。提取的DNA数量和质量使用带有dsDNA结合染料的荧光计和Agilent DNA 1000试剂盒（Agilent，德国）进行分析。

宏基因组序列处理和质量控制

序列读取按照先前描述的方法进行预处理。包含成对末端序列的原始FASTQ文件作为清单文件导入定量微生物生态学洞察2（QIIME2）软件包版本2024.5进行解复用、序列处理、质量过滤和分析。数据导入后，去除条形码序列以实现原始序列数据的解复用。将解复用后的成对末端组装，并修剪重叠10 bp的成对末端读取以去除Illumina适配器和引物。无法组装并在引物匹配中有两个核苷酸错配的读取被丢弃。修剪后的成对末端读取基于质量评分连接，并在平均质量评分为<20的任何位置截断，截断后长度小于50 bp且含有模糊字符的读取被移除。连接后的读取使用Deblur（q2-deblur插件）去噪以过滤噪声序列，去除嵌合体序列，去除单例并去重复序列以生成特征数据和称为扩增子序列变异（ASV）的表格。丰度低于0.25%的ASVs也被移除以减轻因测序错误导致的微生物丰富度膨胀。对ASVs特征数据进行总和缩放（TSS）标准化，以确保所有样本的均匀采样，用于下游多样性分析。总共处理了70个成对末端序列读取用于宏基因组测序，得到3,241,474个质量过滤后的序列，每个样本在质量控制和污染去除后平均获得46,306个序列（表S1）。

微生物群落多样性分析和分类分析

α多样性，衡量个体样本内的物种丰富度和均匀度，通过观察到的物种丰富度、Shannon指数和Shannon有效数从标准化的ASVs计算得出。β多样性，衡量群落组成的变异性，使用Bray-Curtis相异性来测量样本间的微生物相异性，并基于生成的距离度量计算主坐标分析（PCoA）。ASVs根据RES CRIPt裁剪的16S rRNA V3-V4区域99% OTUs参考序列，与预训练的SILVA 138.2数据库进行分类。分类分析在门和属水平上进行。

微生物群落的差异丰度

为了确定癌症患者中的关键细菌分类群，使用LEfSe（线性判别分析效应大小）方法通过Galaxy在线界面（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）进行两两分析。分析将考虑了胃肠道症状的癌症患者与基线对照组进行比较。排除了表现出胃肠道症状的患者，以尽量减少环境因素对结果的影响。首先，LEfSe识别生物分类中的统计显著特征。随后，使用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测细菌分类群的差异。接着，应用线性判别分析模型估计这些特征的效应大小，确定它们是否符合不同生物分类的预期行为。

统计分析

人口统计数据，包括个人识别信息、年龄、性别、症状、诊断、癌症治疗和癌症治疗日期，输入到社会科学统计软件包（SPSS 26.0版，SPSS Inc.，芝加哥，伊利诺伊州，美国）。这些人口统计数据被视为分类变量，并以频率（百分比）表示。在适当的情况下，进行卡方检验或Fisher精确检验以识别变量之间的差异。p值小于0.05被认为具有统计显著性。

使用QIIME2插件中的Kruskal-Wallis两两统计量计算α多样性组显著性。使用置换多变量方差分析（PERMANOVA）基于Bray-Curtis距离计算样本组之间的β多样性，具有999次排列。使用R中的Kruskal-Wallis检验进行三组或更多组之间的差异丰富的属的统计显著性分析。对于组间两两比较，进行Wilcoxon秩和检验以测量丰度显著性。使用R中实现的Benjamin-Hochberg方法通过p.adjust函数校正所得p值的错误发现率。p < 0.05被认为显著。所有结果使用R中实现的“ggplot2”包进行可视化。

结果

研究人群特征

本研究共纳入53名癌症患者和17名健康对照者。其中，36名癌症患者根据其肿瘤的原发部位分类：髓母细胞瘤（n=3）、尤文肉瘤（n=2）、骨肉瘤（n=2）、生殖细胞瘤（n=2）、血管纤维瘤（n=1）、朗格汉斯细胞组织细胞增多症（LCH）（n=1）、急性淋巴细胞白血病（ALL）（n=17）、急性髓系白血病（AML）（n=6）、淋巴瘤（n=1）和幼年型骨髓单核细胞白血病（JMML）（n=1）。其余17名癌症患者因无法从医疗记录中检索其数据而被归类为未分类实体瘤（n=16）和白血病（n=1）。癌症类型之间的样本分布显著不同（p=0.047）（表1）。基于系统发育谱的聚类树显示，相同癌症类型的患者样本不一定聚集在一起，显示出研究组间的个体间变异性（图1）。

表1 癌症患者的基本特征

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图1

聚类树显示基于分类谱的样本聚类，癌症类型的样本略有聚类。ALL=急性淋巴细胞白血病；AML=急性髓系白血病；JMML=幼年型骨髓单核细胞白血病；LCH=朗格汉斯细胞组织细胞增多症。

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大多数样本（n=40）来自接受免疫治疗或化疗的患者，而13名癌症患者为新诊断且尚未接受医疗干预。两组之间在年龄组（p=0.114）、性别（p=0.579）或癌症组（p=0.933）方面没有显著差异。此外，接受治疗的癌症患者要么是有症状的（例如出现腹泻或多个胃肠道症状）（n=19），要么是无症状的（n=21），与主要由无症状患者组成的未治疗组相比，分布显著不同（p=0.002）（表2）。

表2 基于Bray-Curtis距离的成对PERMANOVA统计

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癌症患者与健康对照者的肠道微生物群多样性差异

我们检查了接受治疗的癌症患者和尚未接受治疗的癌症患者的肠道微生物多样性模式。以前的研究表明，胃肠道（GI）症状，尤其是腹泻，可以显著影响肠道微生物群。为了尽量减少环境因素对肠道多样性的影响，我们在分组样本时考虑了GI症状。因此，我们将样本分为四组：有症状且接受治疗（n=14）、无症状且接受治疗（n=21）、无症状且未接受治疗（n=13）和对照组（n=17）。

使用观察到的物种丰富度、Shannon指数和Shannon有效数进行了α多样性分析（图2a、b、c）。对照组的微生物丰富度最高，其次是接受治疗的症状患者、未接受治疗的无症状癌症患者和接受治疗的无症状癌症患者（图2a）。结果表明，与对照组相比，接受治疗的症状患者（Shannon指数：p=0.127；Shannon有效数：p=0.066）、接受治疗的无症状患者（Shannon指数：p=0.003；Shannon有效数：p=0.0003）和未接受治疗的患者（Shannon指数：p=0.127；Shannon有效数：p=0.043）的微生物多样性显著降低。接受治疗的无症状患者的中位α多样性值显著低于未接受治疗的患者（Shannon指数：p=0.042；Shannon有效数：p=0.15）。有趣的是，尽管不显著（Shannon指数：p=0.715；Shannon有效数：p=0.73），但在接受治疗的症状患者中观察到更高的中位α多样性（图2b、c）。

图2

癌症患者在接受治疗前（P）和治疗期间（T）调整GI症状后与健康对照组的α和β多样性测量。(a) 在最低样本深度为4273时观察到的物种丰富度，(b) Shannon有效指数，(c) Shannon有效数。(d) 基于Bray-Curtis相异性的PCoA图显示了癌症患者与对照组之间的显著聚类。箱形图描绘了中位数、四分位数和极值。p值使用Kruskal-Wallis t检验计算，p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, 和 ***p ≤ 0.001。

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我们使用多元统计分析，通过Bray-Curtis相异性距离比较微生物群落结构（β多样性）的差异。我们发现四个组之间的微生物组成存在显著差异，如PERMANOVA测试所示（伪F=2.438，p=0.001）（图2d）。主坐标分析（PCoA）图也表明，三个患者组（有症状且接受治疗、无症状且接受治疗、无症状且未接受治疗）与对照组显著不同，表明微生物群落组成存在差异（图2d）。有症状且接受治疗的癌症患者与对照组的差异最大（PERMANOVA：伪F=4.203，p=0.002），其次是无症状且接受治疗的患者（PERMANOVA：伪F=2.842，p=0.002）和未接受治疗的患者（PERMANOVA：伪F=2.456，p=0.002）。尽管在接受治疗的无症状患者和未接受治疗的患者之间存在一些差异和分散，但结果不具有统计学显著性（PERMANOVA：伪F=0.997，p=0.48；ANOSIM：R=0.078，p=0.946）（表2）。

鉴定与癌症治疗反应相关的特定分类群

在门水平上，所有70个样本中最丰富的门是厚壁菌门（53.1%），其次是拟杆菌门（35.6%）、放线菌门（19.0%）、变形菌门（18.0%）和疣微菌门（6.75%）（图3a）。接受治疗的症状患者的厚壁菌门平均相对丰度最高（53.1%），其次是接受治疗的无症状患者（46.0%）、对照组（45.4%）和未接受治疗的患者（35.2%）。相反，拟杆菌门减少，其最高丰度出现在对照组（35.6%），其次是未接受治疗的无症状患者（25.7%）和接受治疗的患者（21.0%），而在接受治疗的症状患者中丰度最低（10.2%）（图3b）。此外，观察到在未接受治疗的无症状患者中，变形菌门的细菌显著更丰富（18%）相比对照组（6.1%）（Wilcoxon秩和检验，p=0.008）。

图3

癌症患者肠道微生物群的分类分析。(a) 分类条形图显示在接受治疗的症状患者（S+T）、接受治疗的无症状患者（A+T）、未接受治疗的无症状患者（A+P）和对照组在门水平上的微生物组成比较。(b) 在癌症患者接受治疗前（P）和治疗期间（T）调整GI症状后，丰度改变的前五门。基于Wilcoxon秩和检验的两组间成对比较标记为星号，表示显著的相对丰度差异（p ≤ 0.05, p ≤ 0.01, p ≤ 0.001）。(c) 癌症患者和对照组的厚壁菌门/拟杆菌门（B/B）比率。

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在比较厚壁菌门/拟杆菌门（B/B）比率时，发现接受治疗的症状患者的比率显著高于接受治疗的无症状患者（p=0.099）和未接受治疗的患者（p=0.0014），以及对照组（p≤0.001）。然而，在接受治疗的无症状患者和未接受治疗的患者与对照组之间未观察到B/B比率值的差异（图3c）。在属水平上，我们发现基于Kruskal-Wallis t检验（p≤0.05）的18个差异丰富的物种，这些物种在总体分类单元中丰度超过20%（图4）。

图4

热图显示S+T、A+T、A+P和对照组之间丰度超过20%的差异属（Kruskal-Wallis检验，p≤0.05）。

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未接受治疗的无症状患者中，肠球菌属、葡萄球菌属和芽孢杆菌属的水平较高。相比之下，Faecalibacterium属、Segatella属、假单胞菌属和短波单胞菌属的水平相较于对照组显著降低（图5）。接受治疗的无症状患者中，肠球菌属和葡萄球菌属富集，而Collinsella属、Faecalibacterium属、Segatella属、芽孢杆菌属、假单胞菌属和短波单胞菌属相较于对照组减少。我们比较接受治疗和未接受治疗的患者，以确定癌症治疗中的微生物群落差异。我们观察到Bacteroides属、Collinsella属、芽孢杆菌属和Parabacteroides属的细菌减少，但它们在无症状组之间没有差异丰度。同时，接受治疗的症状患者相较于对照组观察到显著较高的肠球菌属和葡萄球菌属，而Bacteroides属、Collinsella属、Faecalibacterium属、Gordonia属、Leuconostoc属、Parabacteroides属和短波单胞菌属减少。Akkermansia属在症状患者中也有所增加，但不具有统计学显著性。为了确定症状患者与无症状患者之间的分类差异，我们比较了接受治疗的患者的分类群。我们观察到肠球菌属和Akkermansia属在症状患者中更为显著地富集。同时，Bacteroides属、Faecalibacterium属和Parabacteroides属在无症状患者中更为丰富，但不具有统计学显著性。

图5

癌症患者在接受治疗前（P）和治疗期间（T）调整GI症状后与对照组之间显著丰富的属。基于Wilcoxon秩和检验显著差异的属丰度被标记为星号（p ≤ 0.05, p ≤ 0.01, p ≤ 0.001）。

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癌症患者与健康对照组的差异微生物谱

我们利用线性判别分析效应大小（LEfSe）方法来确定显著的生物标志物。我们的研究比较了53名正在接受治疗或未接受治疗的癌症患者与17名健康个体。由于β多样性分析未显示两组癌症患者之间的区别，我们将这两组癌症患者合并。我们排除了表现出症状的癌症患者，以消除可能影响肠道细菌的任何环境因素。分析显示，某些类型的细菌在癌症患者中更为常见，其LDA得分大于4.0，包括放线菌目、Planoconcave和肠球菌属。另一方面，对照组中Prevotella属、Dialister属、Oscillospira属、Megasphaera属、Collinsella属和Faecalibacterium属的水平更高（图6）。

图6

癌症患者与健康对照组之间的微生物群落差异丰度。(a) 无症状癌症患者（红色）与健康对照组（绿色）之间的线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析。(b) 进化树显示不同水平下显著不同的分类群及其分支为共享共同祖先的生物群。

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讨论

许多研究报告了癌症患者肠道微生物群的显著变化，但大多数并未聚焦于马来西亚人群。关于马来西亚癌症患者肠道微生物群的研究有限。本研究旨在评估马来西亚癌症患者的肠道微生物群特征，特别是在吉隆坡城市人口中。队列包括正在接受癌症治疗的患者以及新诊断的各种癌症患者，因为招募特定类型的癌症患者面临挑战。样本中还包括出现腹泻或多发性胃肠道症状的患者，以评估经历生态失调的癌症患者中分类群的差异。针对粪便样本中细菌基因组DNA的V3和V4区域的高通量测序揭示了癌症患者与健康对照者之间肠道微生物群多样性和组成的显著差异。

研究发现，接受治疗的患者和未接受治疗的无症状患者表现出显著降低的微生物多样性和微生物组成的显著变异性。这些结果支持了在疾病状态下肠道微生物群多样性减少的假设，导致与健康个体相比的独特微生物组成。尽管先前报告指出癌症治疗会影响肠道微生物群特征，但本研究未观察到接受治疗的患者与未接受治疗的患者之间微生物物种丰富度和组成的显著差异。这种缺乏显著差异的现象可能受多种因素影响，包括癌症阶段、化疗周期数、治疗类型和肿瘤位置。此外，由于样本并非在密集化疗阶段收集，肠道微生物群可能已部分恢复，正如先前研究所建议的。然而，没有在此阶段收集的样本，这些观察结果无法确认。

一些研究报告了与我们相似的结果。根据这些研究，肠道微生物群失调可以在化疗开始之前发生，并持续整个第一年的化疗期间。因此，我们的未治疗组可能已经经历了失调，这通过与健康对照组相比低中位α多样性得以体现。未治疗患者中观察到的变化可能是由于疾病的免疫调节引起的，尽管免疫紊乱的机制尚不清楚，需要进一步研究。

虽然我们未观察到接受治疗和未接受治疗的癌症患者之间微生物组成有显著差异，但我们观察到接受治疗的癌症患者，特别是有症状的患者，表现出更高的Shannon多样性指数和更大的微生物组成变异性。腹泻是这些患者中的常见症状，可能通过增加排便次数、破坏肠道环境和增加粪便水分含量导致这些变化，从而导致观察到的较高α多样性。此外，有症状患者中的高α多样性可能反映了以病原共生体过度生长（如肠球菌属和葡萄球菌属）为特征的失调状态，并伴有Akkermansia属的升高，这是一种与肠道屏障修复相关的粘蛋白降解细菌。这种炎症相关分类群与潜在有益微生物的悖论共存可能表明同时存在治疗诱导的肠道炎症和早期恢复过程。

在我们的研究中，厚壁菌门和拟杆菌门是最主要的门。这与其他关于人类肠道微生物群的研究结果一致。我们观察到在接受治疗的无症状患者和健康对照组之间厚壁菌门/拟杆菌门（B/B）比率没有显著差异。然而，正在接受治疗的癌症患者，特别是有症状的患者，显示出厚壁菌门丰度增加和拟杆菌门丰度减少。这种微生物组成的转变与先前的研究一致，其中儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）患者在化疗前肠道微生物群以拟杆菌门为主，治疗后减少。B/B比率常用于指示微生物失衡和失调，并经常用于反映肠道微生物群障碍。我们在研究中观察到的升高的B/B比率也与其他条件有关，例如肠易激综合症（IBS）。DeFrees和Bailey推测IBS患者细菌门的变化可能与上皮渗透性和肠道炎症的变化有关。此外，我们的研究结果表明，假单胞菌门，特别是在无症状患者中显著富集。Hakim等人报告称，假单胞菌门的增加与中性粒细胞减少的风险增加相关。假单胞菌门作为肠道微生物群失衡和疾病风险增加的标志物的作用在免疫正常和免疫抑制患者中均有充分记录。

进一步的属水平分析显示，与对照组相比，癌症患者中肠球菌属的细菌更为普遍，尤其是在有症状的患者中。然而，我们的研究未发现接受治疗的患者与未接受治疗的患者之间肠球菌属丰度的显著差异。这种差异的缺乏可能受到前述多种因素的影响，我们承认这是研究的局限性之一。尽管如此，我们在有症状的患者中观察到肠球菌属和葡萄球菌属丰度的显著增加。Hakim等人证实，这些分类群的增加可能使患者更容易出现中性粒细胞减少和腹泻性疾病的风险。

肠球菌属是乳酸菌生产菌，通常在健康个体的胃肠道中发现。越来越多的证据表明肠球菌属在癌症治疗中的作用。一些物种，如粪肠球菌和屎肠球菌，可以产生具有抗菌和抗癌特性的肠毒素，并促进负责识别和摧毁癌细胞的淋巴细胞的活性。另一方面，肠球菌属（特别是粪肠球菌和屎肠球菌）也可能引起机会性医院感染。粪肠球菌占人类临床肠球菌感染的80-90%，而屎肠球菌占5-15%。在结直肠癌中，粪肠球菌已被证明能产生损害肠屏障和诱发炎症的代谢产物。根据Hakim等人的研究，相对丰度超过30%的肠球菌预测急性白血病患者后续发热性中性粒细胞减少和腹泻性疾病的风险显著增加。

我们发现负责生产代谢产物的重要细菌，如拟杆菌属、粪杆菌属、短波单胞菌属和假单胞菌属显著减少。这些细菌在生产代谢产物和短链脂肪酸（SCFA）方面起着关键作用，这对于维持肠道平衡至关重要。丁酸、丙酸和乙酸等短链脂肪酸是结肠中产生的关键代谢产物，为肠黏膜提供能量。它们有助于增强黏膜屏障，以其抗癌和抗炎特性著称。这些有益细菌的减少可能会损害肠道屏障的完整性，可能导致肠道损伤并增加细菌易位的风险，正如观察到的肠球菌和葡萄球菌进入血液的情况。因此，这些保护性细菌的缺失可能会损害肠道屏障的完整性，使癌症患者更容易受到肠球菌感染。我们的线性判别分析显示，癌症患者肠球菌水平较高，而产代谢物的细菌如Prevotella、Dialister、Oscillospira、Megasphaera、Collinsella和Faecalibacterium减少。这些变化是癌症患者微生物群失衡的重要指标。重要的是，肠球菌属的存在可能被视为癌症患者的潜在生物标志物，正如在结直肠癌、肺癌和急性淋巴细胞白血病的各种研究中一致观察到的那样。

尽管我们的研究提供了有用的信息，但它也有局限性。首先，由于COVID-19限制，我们无法招募匹配的健康对照组，因此我们从已发表的文章中获得了马来西亚人群的健康个体数据集，并得到了作者的同意。此外，由于招募特定癌症患者的挑战，我们的研究包括了各种恶性肿瘤的癌症患者，导致每种癌症类型的样本量较小。因此，我们无法充分探讨不同癌症类型对肠道微生物群组成的影响。尽管我们确认癌症类型之间没有明显聚类，并注意到样本间的个体差异，但我们认识到不同癌症类型可能对肠道微生物群有不同的影响。

本研究的另一个局限性是无法收集详细的临床数据，如癌症分期、化疗周期数、治疗方案类型和一些未分类样本的具体癌症类型，这是由于伦理批准限制，无法访问患者的医疗记录所致。因此，我们无法充分评估患者在样本采集时的整体健康状况和免疫抑制状态。这些信息对于理解癌症患者肠道微生物群失调的原因和影响至关重要。未来的研究应基于我们的基线发现设计方法时考虑这些因素。

此外，我们没有收集饮食信息，这是一个影响肠道微生物群组成的主要因素。虽然马来西亚是一个多文化国家，不同种族群体可能共享类似的营养和文化方面，但饮食对我们研究结果的潜在影响不容忽视。癌症患者的饮食习惯可能与普通人群显著不同，这些差异可能影响肠道微生物群的组成。此外，比较马来西亚癌症患者与西欧和东亚癌症患者的饮食对肠道微生物群的影响，可以提供有价值的见解，了解文化和营养差异如何影响癌症患者的肠道微生物群。此外，采用纵向方法将能够捕捉治疗症状和副作用后的饮食模式变化。另一项潜在的研究途径是进行干预研究。实施受控饮食干预将使我们能够观察特定饮食对微生物群组成直接影响。

在未来的研究中承认和解决这些局限性将增强我们对饮食、肠道微生物群和癌症之间关系的理解。同样，我们的研究缺乏纵向方法，这将显著提高我们对癌症及其治疗对癌症患者肠道微生物群影响的理解。进行纵向研究需要患者随访，可能因缺乏合作而面临挑战。然而，这类研究至关重要，因为它们允许访问肠道微生物群随时间的动态变化，不仅响应癌症治疗，还随着癌症患者症状的发展而变化。此外，由于我们的参与者均来自单一医院，我们无法评估肠道微生物群的潜在区域差异。未来的研究应通过多中心样本收集来解决这一限制，以验证我们的发现。从多家医院收集样本将提供更广泛和更具代表性的数据集，考虑到可能影响肠道微生物群组成的地理和环境差异。此外，应用机器学习（ML）方法识别与转移或治疗反应相关的微生物模式代表了一个有前景的研究方向。机器学习技术可以分析复杂的数据集，揭示传统方法可能忽略的隐藏模式和关系。通过利用这些先进的分析工具，研究人员可能识别出与疾病进展和治疗结果相关的特定微生物特征。

结论

总之，这项研究强调了癌症患者与健康个体之间肠道微生物群多样性和组成的显著差异。我们的发现与炎症性肠病（IBD）患者一致，表现为厚壁菌门/拟杆菌门比率的扩大。虽然我们通常未观察到接受治疗的患者和未接受治疗的患者之间微生物组成的显著差异，但多样性分析证实了癌症患者与健康对照组之间的微生物失衡。这些失衡在接受治疗的有症状患者中尤为明显，他们表现出肠道失调。我们还注意到癌症患者中肠球菌属的丰度显著增加，尤其在有症状的患者中，而有益细菌减少。这种肠球菌属的过量存在，作为一种微生物失衡的标志，在众多研究中已有记录，可能被视为癌症患者的潜在生物标志物。未来的研究需要阐明肠球菌属如何影响癌症进展和治疗结果的机制。进行纵向研究并解决本研究中突出的局限性，将提供对肠道微生物群与癌症之间关系的深入理解。

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