表面弹性水凝胶通过调节氧化还原稳态和细胞骨架张力延缓衰老

Surface-elastic hydrogels delay senescence via the modulation of redox homeostasis and cytoskeletal tension

摘要：骨髓间充质干细胞（MSCs）因其治疗特性被广泛应用于临床。然而，在组织培养皿中扩增MSCs会诱导复制性衰老（RP），从而降低其质量和数量。本研究通过分析工程化刚度可调的明胶水凝胶上预处理和连续传代的MSCs，揭示了基底刚度作为潜在调节器延缓MSC衰老的作用机制。结果表明，机械激活增加了MSCs的自由基清除能力，维持了氧化还原稳态，恢复了肌动蛋白动态，并保留了其治疗特性。这些水凝胶减轻了过氧化氢诱导的氧化应激，将机械信号与氧化还原平衡和衰老联系起来。此外，水凝胶还恢复了肌动蛋白重塑，突显了细胞骨架张力和动态在细胞衰老中的重要性。我们建立了一种新的培养方法，通过在逐步表面弹性水凝胶上传代细胞来维持MSCs的干性、增殖、运动性和成骨分化潜能。证据表明机械记忆与肌动蛋白动态之间的复杂相互作用及其对通过水凝胶延缓衰老MSCs自噬活性的影响。我们的研究结果表明，培养基质的机械调节精细调控了细胞应激、氧化还原稳态和细胞骨架动态之间的平衡，从而延缓MSCs衰老的进程。

引言：细胞衰老被定义为长期培养后不可逆的细胞周期停滞。这一过程被认为是衰老的标志，由各种信号和不同类型的应激源触发，如氧化应激、化学物质、辐射和复制耗竭。衰老细胞表现出典型的表型，例如形态变化为扁平且不规则形状，β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性升高以及p21和p53等细胞周期抑制因子上调。氧化还原稳态和细胞骨架完整性是干预衰老和年龄相关疾病进展的关键目标。活性氧（ROS）和抗氧化剂之间的平衡对正常细胞生理至关重要，并通过影响细胞骨架完整性部分地参与衰老和病理过程。包括肌动蛋白纤维、微管和中间纤维在内的细胞骨架在增殖、迁移和线粒体信号传导中起着关键作用。在衰老细胞中，氧化还原失衡增加线粒体功能障碍和ROS积累，同时失调肌动蛋白和微管动力学。

结果：表面弹性可调的明胶水凝胶能够延缓MSC衰老进程。使用LED照射制备的明胶水凝胶的表面弹性随曝光时间和光引发剂浓度增加，这通过原子力显微镜评估得到验证。为了研究老化MSC如何与机械基质相互作用，晚期传代MSC被接种在组织培养皿（TC）、软（S，3–5 kPa）、中等硬度（M，8–10 kPa）和硬（H，20–40 kPa）水凝胶上，并通过SA-β-GAL染色评估衰老情况。与TC相比，无论表面弹性如何，预处理在水凝胶上的MSC显示出明显较弱的SA-β-GAL染色。定量分析使用SPiDER-GAL荧光探针和流式细胞术进行。早期传代MSC表现出低荧光强度。阳性对照抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）降低了TC上晚期传代MSC的荧光信号。与NAC处理的细胞一致，所有水凝胶条件显著降低了MSCs的SPiDER-GAL荧光信号。基底弹性减少了水凝胶和NAC处理细胞上MSCs的衰老标志物（β-半乳糖苷酶、p21和p53）表达。未发现S、M和H水凝胶细胞间的显著基因表达差异。涂有苯乙烯化明胶（StG）的TC用于评估更硬基底对MSC衰老状态的影响。结果显示，涂有0.3% StG的TC减少了衰老，但抑制效果不如水凝胶明显。

这些数据表明，与TC相比，水凝胶可以延缓MSCs的衰老进程。

表面弹性可调水凝胶能够维持氧化还原稳态并减轻MSCs的应激诱导氧化应激。我们通过分析线粒体变化和ROS生成，探讨了机械刺激对老化MSC氧化还原调节的影响。在刚性基底上，晚期传代MSC显示围绕核和细胞质区域的强烈线粒体积累染色。年轻MSC和水凝胶之间未观察到显著的染色模式差异。刚性基底上的晚期传代MSC比水凝胶和NAC处理组具有显著更高的荧光强度。晚期传代MSC显示出比早期传代MSC更高的线粒体ROS荧光，而NAC处理后ROS水平下降。水凝胶显著降低了晚期传代MSC的线粒体ROS生成。在涂有StG的TC上，ROS水平也有所下降，但程度低于水凝胶。

为了深入了解机械刺激对氧化还原稳态的影响，使用H2O2诱导氧化应激，并评估细胞应激反应和衰老情况。在应激诱导的早衰（SIPS）对照实验中，用H2O2处理MSC高度上调了NRF2、抗氧化基因和衰老标志物。由于所有水凝胶，无论表面弹性如何，都减少了ROS生成并抑制了衰老，因此选择H水凝胶作为进一步评估的模型基底。与TC相比，水凝胶部分抑制了H2O2诱导的氧化应激效应。SA-β-GAL在氧化应激诱导后在TC上比在水凝胶上显示出更强的染色。在水凝胶上的SIPS MSCs中，应激反应、细胞保护和长寿相关基因显著上调。基于γ-H2AX染色，水凝胶上的细胞显示出较少的DNA损伤灶。为了确认氧化还原稳态与衰老之间的关联，进行了NRF2基因沉默。结果表明，NRF2敲低增强了水凝胶和TC上MSCs的衰老，伴随着其他替代应激反应分子的补偿性上调。

细胞骨架张力与衰老：进一步研究了细胞骨架张力在MSC衰老中的作用。晚期传代MSC显示出与早期传代MSC不同的细胞骨架结构，表现为扩展增加、体积增大、丰富的vinculin和粗大的应力纤维。相比之下，水凝胶上的晚期传代MSC具有较少的vinculin和较细的肌动蛋白纤维。水凝胶显著减小了细胞面积。用ROCK抑制剂Y-26732处理MSC减少了细胞大小，降低了SA-和SPiDER-GAL，并下调了衰老标志物。

连续传代在水凝胶上的MSC延缓了衰老。迄今为止的结果表明，MSCs在柔顺水凝胶上的预处理可以维持氧化还原稳态，减少细胞骨架张力，增加肌动蛋白重塑，并抑制衰老。为了确认水凝胶在长期维持MSCs方面的性能，我们在TC、S、M、H和SMH水凝胶上连续传代细胞。与预处理实验结果一致，水凝胶显示出减少的SA-β-GAL染色和下调的衰老标志物。

连续传代在水凝胶上的MSC维持了治疗潜力。我们进一步研究了水凝胶维持老化MSC治疗潜力的能力。在复制性衰老中，MSCs显示出增殖标志物Ki67和干性标志物meflin表达下降。而连续传代在SMH水凝胶上的MSC上调了这两个基因。Ki67蛋白的免疫荧光染色证实SMH水凝胶显著促进了细胞增殖。在TC中，倍增时间从~30小时增加到~46小时。在单刚度水凝胶上培养晚期细胞延长DT至50-60小时。来自SMH的晚期细胞DT（~40小时）比TC细胞短，但仍比年轻细胞长。在每种基底刚度条件下连续传代MSC并未改变MSC表面标志物Stro-1的表达。

我们检查了水凝胶对MSC成骨分化潜力的影响，因为细胞在老化过程中失去了这种特性。结果表明，来自S水凝胶的MSC显示出较弱的成骨分化潜力趋势，与较硬的基底相比。来自H和SMH水凝胶的MSC钙生成量高于TC-LP凝胶，而只有后者显示出显著差异。结果清晰显示了在SMH水凝胶上诱导MSC四周后骨结节形成的形成。脂肪生成诱导也进行了，但没有观察到明显的差异。

为了探讨柔顺水凝胶是否能挽救更老细胞的治疗特性，我们进一步研究了SMH水凝胶对后期传代MSC（P20）的影响，因为这种凝胶条件在维持MSC特性方面表现最佳。在TC上老化的细胞DT显著增加至~80小时，而在SMH上则降至约67小时。SMH水凝胶增加了MSC的运动性。与年轻传代（P16）观察到的结果一致，来自SMH水凝胶的MSC具有更高水平的钙生成。

讨论：细胞保留机械记忆，这可能影响可塑性和命运。刚性的TC表面可能会偏倚细胞功能并促进复制性衰老。基底刚度最初被识别为MSC命运决定中的关键性质；然而，其在衰老研究中的应用仍然有限。最近的研究强调了生物材料延缓衰老的潜力，但由于MSC异质性、细胞衰老的复杂性以及制造大规模生物材料用于长期体外扩增的挑战，对于柔顺基底如何实现这一点的基本理解仍然有限。使用功能性聚乙二醇二丙烯酸酯水凝胶修饰各种粘附配体以确定支持MSC增殖、增强旁分泌因子分泌和减少复制性衰老的基底特性，尽管需要进一步优化以实现大规模治疗生产。一项最新研究表明，pH响应药物释放水凝胶促进了椎间盘再生，减少了衰老并缓解了大鼠模型中的疼痛。虽然这些研究强调了生物材料在衰老研究中的潜力，但它们主要关注整体基质刚度，其中水凝胶的弹性模量在宏观尺度上调节，并通常使用剪切流变学或理论估计测量。这些工作未考察表面弹性，描述了直接接触细胞的水凝胶纳米级界面层的机械阻力。相反，我们的研究明确调查了这一特定于表面的属性及其生物学影响，提供了一种新颖的机械生物学视角。

高效控制MSC衰老和年轻化对于改善健康和寿命至关重要。理解这些机制将有助于制定更好的抗衰老策略，并为年龄相关疾病的见解提供帮助。先前的基础研究提供了关于水凝胶性质如何影响MSC行为和衰老表型的关键机制见解。受这些重要贡献的启发，我们的工作研究表面弹性作为细胞-材料相互作用的一个额外、以前未充分探索的维度，提供了更为局部化的机械转导视角。我们的研究表明，表面弹性可调的明胶水凝胶能够延缓MSCs的衰老表型。我们采用基于AFM的纳米压痕技术量化水凝胶表面的弹性模量，达到纳米级分辨率。LED光照引发的凝胶化方法生成了具有广泛杨氏模量的细胞粘附性凝胶，模仿天然组织。这种简单的制造技术允许规模化生物材料生产，无需额外的表面功能化步骤，使其成为治疗应用中大规模MSC扩增的理想选择。在最近的一项研究中，0.1-0.5%明胶涂层TC的杨氏模量略有下降，但相对于未涂层TC（~5 GPa）而言，下降幅度可以忽略不计（~3 GPa），仍被视为刚性基底。我们研究中的0.3% StG涂层TC显示出比水凝胶更少的衰老抑制，表明柔软的机械微环境是延缓衰老的关键因素。

基质刚度调节线粒体形态、动力学和定位。衰老细胞具有增加的线粒体质量和功能失调线粒体的积累。我们的结果表明，水凝胶减少了线粒体积累，降低了线粒体ROS水平，并抑制了衰老。线粒体通过马达蛋白沿肌动蛋白移动，微管引导其转移——这些过程影响氧化应激和衰老。顺应性水凝胶可能通过保持细胞骨架结构和氧化还原平衡来增强线粒体-细胞骨架相互作用。

为了突出氧化还原平衡在衰老机械调节中的重要性，进行了SIPS以诱导衰老。水凝胶上的MSC显示出比TC上的细胞更少的衰老进展，表明对外源H2O2解毒有更好的ROS清除能力。NRF2蛋白的低基础表达和补偿性反应限制了我们清楚定义其具体作用的能力。NRF2敲低细胞在TC和凝胶条件下的相似衰老状态表明，NRF2不是唯一因素，而是延缓衰老的几个贡献者之一。

虽然NRF2似乎发挥了作用，但应激反应基因的补偿性上调表明了一个更复杂的调控网络。当NRF2被敲低时，细胞失去对抗氧化应激的关键防御，并通过替代途径（如过氧化氢酶、过氧化还原酶或硫氧还蛋白）部分恢复氧化还原平衡，导致其他应激反应分子的上调。不同的基底刚度触发了不同的补偿性反应，突出了维持MSC稳态和延缓衰老中氧化还原平衡的重要性。特别是，在水凝胶上的SIPS模型中上调的转录因子，如叉头盒O转录因子（FOXO）、代谢传感器如AMP激活的蛋白激酶（AMPK）和硫氧还蛋白（TRX），是未来机制研究的有力候选者。AMPK激活增强了氧化损伤修复，而FOXO3a调节应激反应、长寿，并激活抗氧化基因如超氧化物歧化酶和TRX以对抗氧化损伤。这些基因在水凝胶上的SIPS MSCs中上调表明它们参与抗氧化调节，帮助细胞适应氧化应激。对其相互联系的进一步研究将加深我们对衰老和机械调节的理解。

衰老细胞变得更僵硬，并失去响应刺激重新排列细胞骨架的能力。细胞骨架张力对肌动蛋白应力纤维完整性至关重要。在具有厚应力纤维的复制性衰老细胞中观察到衰老响应应力纤维蛋白的上调。在TC上的衰老细胞表现出大的粘着斑和厚的肌动蛋白纤维，反映了高细胞骨架张力。Y-27632是一种用于年龄相关疾病的细胞骨架张力抑制剂，减少了细胞大小和衰老标志物的表达，突出了异常张力在衰老中的作用。RhoA是ROCK的上游调节因子，在结合时激活ROCK并调节细胞形态、迁移和自噬体形成。RhoA/ROCK通路控制肌动蛋白重塑和肌球蛋白收缩性，增加细胞骨架刚性。该通路的激活通过响应机械线索调节F-肌动蛋白聚合促进细胞衰老。该报告与我们的结果一致，显示抑制RhoA/ROCK减少细胞骨架刚性和细胞衰老，表明通过调节细胞骨架张力可以延迟或逆转这种细胞状态。

MSCs的衰老影响抗氧化活性和肌动蛋白周转。与这项研究一致，具有较低细胞骨架动态的老化细胞对JAS的反应延迟，表现为具有完整肌动蛋白纤维的细胞比例更高，塌陷的肌动蛋白纤维更少，与年轻细胞相比。凝胶上细胞的反应与年轻细胞相似，表明凝胶上MSCs的肌动蛋白重塑得到了恢复。这些结果突出了细胞骨架张力和动态在细胞衰老中的重要性。

最终也是最重要的目标是证明水凝胶在挽救MSCs治疗特性方面的年轻化能力。连续传代在水凝胶上的MSCs显示出显著抑制的衰老和减少的ROS，而不影响Stro-1表达，这与先前的研究一致，即MSC表面标记物随着传代次数的增加保持不变，并在凝胶上长期培养后保持不变。在单刚度水凝胶上长期培养老化MSCs不能促进增殖，这与其他发现一致，即柔软基底减少MSCs增殖。

MSCs的运动性对基于细胞的疗法的功效至关重要。老化MSCs中减少的ROS防御和降低的肌动蛋白动态会影响其功能，包括运动性，从而降低其再生潜力。在我们的研究中，虽然单刚度水凝胶不能支持细胞增殖，但柔软水凝胶可以将细胞运动性恢复到与年轻细胞相当的水平。进一步优化在柔软微环境中维持增殖和促进MSCs其他有益特性的平衡将对再生医学领域做出重大贡献。

维持MSCs增殖和分化潜力的生物材料对未来治疗应用至关重要。在这项研究中，我们建立了使用SMH凝胶的文化条件，以挽救增殖潜力，维持干性，并增强MSCs的运动性。与其他基底相比，只有SMH凝胶显著增加了meflin的表达。Meflin是具有增强再生潜力、自我更新和分化能力的特定MSC亚群的标志物。虽然其潜在机制尚不清楚，但在SMH凝胶衍生的MSCs中meflin的上调为治疗应用提供了多项益处。

我们研究了水凝胶对成骨分化的影响，这是MSCs的关键治疗特性，难以在老化过程中维持。我们的研究结果表明，来自S和M凝胶的MSCs的钙生成略低于其他样品。这并不意外，因为这些刚度范围不适合支持成骨分化。有利于成骨的H凝胶显示出比柔软基底更高的钙沉积，并略微增强了比TC的沉积。SMH凝胶维持了成骨分化潜力，如显著增加的钙生成和增强的骨结节形成所示。我们没有观察到凝胶和TC之间细胞的脂肪生成性有显著差异，正如之前的报告。这种差异可能是由于供体间的变异或研究的生物材料和粘附配体的不同特性所致。我们进一步确认了SMH凝胶在较老细胞中的功能恢复能力，并观察到类似的趋势。虽然与年轻细胞相比，DT无法逆转，但SMH凝胶在维持MSCs再生能力方面仍然优于TC，因为它们的运动性和成骨潜力可以得到恢复。

来自SMH的MSCs特征似乎不同于单刚度H凝胶，表明两种培养条件激发了不同的调控路径。最佳的细胞骨架完整性与寿命和衰老相关。在老化MSCs中，改变的染色质结构沉默了维护和修复基因。细胞骨架张力影响染色质结构，促进松弛并增强与细胞周期进展相关的基因表达。机械记忆由染色质的表观遗传重塑调节，机械振幅可诱导转录记忆，促进MSCs增殖。在SMH系统中，逐步调节收缩力和细胞骨架张力，并避免在扩增过程中单一刚度的机械记忆印记，可能有助于提高MSC质量。细胞骨架张力诱导的表观遗传修饰可能解释了SMH凝胶上MSCs增殖的增强，这需要进一步探索。

我们研究了在每种刚度条件下连续扩增后将细胞转移到刚性基底的记忆。核YAP水平表明细胞记住了它们之前的物理环境。这些记忆与它们的成骨分化潜力相关，在较硬基底上MSCs的N/C比率较高且增强，而在N/C比率较低的样本中受到抑制。从SMH凝胶中MSCs的YAP激活恢复支持了这样的观点：将细胞暴露于逐步表面弹性的基底避免了机械记忆的印记并提高了它们的质量。

减少的肌动蛋白动态导致线粒体去极化和ROS生成增加。TAGLN是肌动蛋白动态和应激反应的调节因子，在衰老细胞中通常升高。我们观察到水凝胶中MSCs的TAGLN下调，强调了CSK动态在延缓衰老中的关键作用。然而，在水凝胶样品之间没有观察到显著差异，表明其他因素参与了SMH凝胶上MSCs的机械激活。

CSK机械性质影响自噬体的形成和运动，这与肌动蛋白丝相关。在衰老过程中，自噬活动通常受损；然而，在某些情况下，观察到长时间培养后RP MSCs自噬活动水平升高。在我们的系统中，我们观察到RP细胞中ATG5的上调，而在SMH凝胶中该基因被下调，表明自噬的机械调节可能有助于增加MSC功能维持能力。然而，这必须通过在不同基底弹性上对特定自噬基因进行功能获得和丧失研究来证明，以阐明它们在延缓衰老和促进年轻化中的参与。SMH凝胶最佳功能维持能力的机制仍然难以捉摸，需要使用全球组学进一步研究。

总之，本研究结果表明，顺应性水凝胶可以作为MSC培养的合适微环境。培养在水凝胶上的MSCs具有更高的自由基清除能力，可以更好地维持氧化还原稳态，减少细胞骨架张力，并增强肌动蛋白动态的恢复。通过在SMH水凝胶上长期培养MSCs，可以延缓或逆转衰老表型，从而维持其治疗特性。细胞骨架张力和机械记忆增强细胞机械敏感性，帮助MSCs响应机械线索并维持完整性以对抗衰老相关变化。

材料与方法：细胞培养：人原代MSCs（Lonza，东京，日本）在第3-33代使用间充质干细胞基础培养基（Lonza）培养。细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中维持在TC上。早期传代（EP，P5-8）、中期传代（P9-11）和晚期传代（LP，≥P12）用于评估响应基底刚度的衰老和年轻化。对于复制性衰老对照，细胞在TC上培养3-4天并连续传代直到达到晚期传代。

制备不同表面弹性的明胶凝胶：为了制备具有不同表面弹性的细胞粘附性水凝胶，按照先前描述的方法在实验室合成光固化苯乙烯化明胶（StG）。简而言之，将含有StG（30% w/w；取代度：100%）和水溶性磺酰基樟脑醌（2.5-3% w/v明胶）的磷酸盐缓冲液溶液铺展在乙烯基硅烷化玻璃基底和聚（N-异丙基丙烯酰胺）（Sigma Aldrich，圣路易斯，密苏里州）涂层玻璃基底之间。使用LED面板灯（5.2 mW/cm² at 488 nm；光源：LMG150×180NW；AITEC SYSTEM，日本）诱导凝胶化。每个水凝胶的表面弹性使用微压痕分析确定，如前所述。使用原子力显微镜（JPK NanoWizard 4，JPK Instruments，Bruker Nano GmbH，德国）测量水凝胶表面的力-压痕曲线，使用标称弹簧常数为0.03-0.09 N/m的商业硅氮化物悬臂（qp-BioAC-CI CB3，Nanosensors）在至少三个不同样品的五个随机选择点（九个50×50 µm弹性图）测量。通过将其拟合到赫兹模型评估表面的杨氏模量。为了在各种表面弹性基底上体外培养和扩增MSCs，细胞在补充有10%胎牛血清（Gibco BRL）、100单位/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco BRL，美国纽约州格兰德岛）中培养。对照StG涂层TC通过将StG稀释在蒸馏水中获得最终浓度0.3%（v/v）并过滤灭菌制备。将稀释溶液加入35 mm培养皿中并在37°C下孵育30分钟。弃去溶液并将培养皿风干超过2小时。在接种细胞之前，用磷酸盐缓冲液冲洗两次StG涂层培养皿。

图S22展示了在每种基底刚度条件下MSC培养的示意图。对于预处理实验，MSCs以4,000 cells/cm²的密度接种在TC、软（S，3-5 kPa）、中等硬度（M，7-10 kPa）和硬凝胶（H，20-40 kPa）上四天。抗氧化剂处理的对照组通过用含1 mM NAC（FOCUS Biomolecules，宾夕法尼亚州，美国）的新鲜培养基补充细胞制备。对于长期体外扩增，MSCs在基底上培养四天并在相应的基底上连续传代两个周期。通过首先在软凝胶上培养细胞四天，然后在最后一个周期中连续传代并在中等和硬凝胶上培养，实现了水凝胶刚度逐渐增加的MSCs长期扩增，称为SMH条件。使用CM30培养监测系统（Evident）监测细胞增殖。使用Fiji软件对播种后第2天和第4天在每种基底条件下获得的MSC图像进行细胞计数，并使用获得的细胞数计算DT。

衰老相关β-半乳糖苷酶染色：使用SA-β-GAL试剂盒（Cell Signaling Technology，丹佛斯，马萨诸塞州，美国）和荧光探针SPiDER-β-GAL（Dojindo，熊本，日本）根据制造商说明评估衰老程度。SPiDER-β-GAL提供了更高的灵敏度和对SA-β-GAL的特异性增加，因为染色程序还包括抑制内源性β-半乳糖苷酶活性的巴菲洛霉素A。这种方法提供了量化能力，同时减少了背景噪声和缩短了孵育时间。使用BZ-X700（Keyence Corporation，大阪，日本）和20×物镜获得SA-β-GAL染色细胞的彩色图像。使用流式细胞仪（Guava EasyCyt Flow Cytometer；Millipore，日本）评估SPiDER-β-GAL染色细胞的荧光信号。

线粒体ROS检测和线粒体染色：MSCs在不同刚度的基底上培养五天，并使用MitoSoxRed（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific）进行线粒体ROS染色。细胞用无酚红汉克平衡盐溶液（Fujifilm Wako，东京，日本）洗涤两次，并用4 µM MitoSoxRed染色20分钟。收集染色的细胞进行流式细胞术。

对于线粒体染色，细胞用补充有10%胎牛血清和抗生素的无酚红Leibovitz L-15培养基（Thermo Fisher Scientific）洗涤两次。MSCs的线粒体用稀释在L-15培养基中的25 nM MitoBrightGreen（Dojindo）染色。按照制造商说明，使用NucBlue™ Live Ready Probes™（Molecular Probes，Thermo Fisher Scientific）共染色细胞核。孵育15分钟后，用培养基洗涤样品两次，并使用BZ-X700显微镜的60×油物镜和结构照明显微功能观察活细胞中的荧光信号。使用Fiji软件量化核周区域的线粒体强度。NucBlue染色用于识别细胞核并创建感兴趣区域（ROI）。使用NucBlue ROI选择MitoBright Green染色细胞的细胞核。为了量化核周荧光，ROI扩展了15像素以测量综合密度，并从中减去MitoBright Green染色细胞核的强度。

SIPS诱导和自由基清除能力评估：如前所述诱导SIPS。细胞过夜稀疏接种并用200 µM H2O2处理2小时。细胞用新鲜培养基洗涤两次并培养四天。然后重新接种细胞并以类似方式再处理两次H2O2。在本研究中，SIPS用于评估MSCs在响应不同基底刚度值的氧化损伤时的自由基清除能力。MSCs在基底上培养四天后进行H2O2处理。细胞用新鲜培养基洗涤并在新鲜培养基中培养四天后进行SA-β-GAL染色、样品收集用于基因表达分析和DNA损伤相关蛋白的免疫荧光染色。

抑制剂处理：MSCs在存在2 µM ROCK抑制剂Y-27632（Sigma Aldrich）的情况下在TC上培养五天。细胞重新接种并在无抑制剂的情况下培养两天以测量细胞面积。对于SA-β-GAL、SPiDER -β-GAL染色和基因表达分析，MSCs培养两天并在染色和RNA分离前用25 µM Y-27632处理四天。

使用浓度为250 nM的稳定肌动蛋白剂jasplakinolide（JAS，Adipogen® LIFE SCIENCE，加利福尼亚州，美国）评估肌动蛋白重塑。MSCs在TC和H凝胶上维持四天并重新接种在TC上两天。细胞在用罗丹明-鬼笔环肽（Cytoskeleton Inc. Denver，Co，美国）和DAPI（Sigma Aldrich）染色前用JAS处理24、48、60、72、92和120分钟，遵循制造商提供的协议。使用BZ-X700和20×物镜捕获细胞的荧光图像，并使用Fiji软件（https://fiji.sc/）分析含有塌陷和完整肌动蛋白丝的细胞数量。

使用延时分析测量细胞面积和评估细胞运动性：在EP和LP MSCs中研究RP细胞的形态和运动性变化。MSCs在水凝胶和TC上培养四天以使用calcein-AM染色方法测量细胞面积。按照制造商说明用calcein-AM染料（Invitrogen）染色细胞。使用BZ-X700和10×物镜捕获细胞的荧光图像，并使用Fiji量化面积大小。

使用CM30培养监测系统获得的图像进行相差延时分析。对于凝胶实验，MSCs在TC、S、M、H和SMH凝胶上连续传代并在TC上重新接种两天以进行延时观察。电影记录18小时，间隔15分钟。使用Fiji中的MTrackJ插件手动跟踪移动细胞的细胞核中心以获得累积迁移距离和速度。

免疫荧光染色：按照先前描述的方法对在各种刚度基底上培养的MSCs进行免疫荧光染色。细胞与以下一抗孵育：多克隆抗小鼠；Ki-67（Cell Signaling and Technology，东京，日本），多克隆抗兔；组蛋白-H2AX pSer139（γ-H2AX，Novus Biologicals，CO，美国），53BP1（Genetex，CA，美国），多克隆抗小鼠；inculin（Santa Cruz Biotechnology Inc.，CA，美国），多克隆抗兔；YAP1（Genetex），二抗（驴抗兔结合Alexa Fluor@488，驴抗小鼠结合Alexa Fluor@488，和驴抗兔结合Alexa Fluor@568（Invitrogen）。添加罗丹明-鬼笔环肽以固定F-肌动蛋白丝。使用BZ-X700显微镜捕获图像。使用Fiji软件量化YAP核和细胞质比率。使用以下公式计算N/C比率：（核YAP强度/面积）/（细胞质YAP强度/细胞质面积）。通过在不进行膜渗透步骤的情况下将细胞与一抗Stro-1抗小鼠IgM（R&D；System™，MN，美国）和二抗山羊抗小鼠IgM-FITC（Santa Cruz Biotechnology Inc.，CA，美国）孵育来进行Stro-1的免疫荧光染色。

RNA表达分析和基因沉默：使用Direct-Zol Microprep RNA纯化试剂盒（ZYMO RESEARCH，CA，美国）从在各种表面弹性基底上预处理或连续传代的MSCs中分离RNA。按照先前描述的方法进行DNase消化、逆转录和定量实时聚合酶链反应（qPCR）。参考基因次黄嘌呤磷酸核糖转移酶和pumilio RNA结合家族成员1用于标准化基因表达。使用小干扰RNA进行NRF2的基因沉默。MSCs在基底上培养四天。包括scrambles（sc-37030，Santa Cruz Biotech）和NRF2（sc-37030，Santa Cruz Biotech）的小干扰RNA按照制造商协议使用Lipofectamine RNAiMax转染试剂（Invitrogen）递送到细胞中。孵育24小时后，收集样品用于RNA分离、qPCR分析和SA-β-GAL染色。

评估MSCs的分化潜能：通过在TC、S、M、H和SMH凝胶上连续传代细胞并在TC上重新接种两天后诱导来确定LP MSCs的分化潜能。在细胞达到70-80%汇合度时使用成骨补充剂（PromoCell，海德堡，德国）进行成骨诱导两周和四周。使用茜素红S染色钙矿化，并使用BZ-X700显微镜获得相差彩色图像。使用10%十六烷基吡啶鎓氯化物在37°C下提取钙基质15分钟。将上清液转移到96孔板中，并在570 nm处测量吸光度。

通过在Minimal Essential Medium（Fujifilm Wako，东京，日本）中培养细胞直到100%汇合度来诱导脂肪生成分化。使用Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit（R&D；System™）的脂肪生成补充剂进行两周诱导。使用油红O染色脂滴，并使用BZ-X100获得相差彩色图像。

统计分析：所有数据均来自至少三个独立实验，并表示为平均标准差。进行非参数Kruskal-Wallis检验，随后进行事后检验以评估细胞面积、运动性和肌动蛋白重塑。所有qPCR比较实验均进行普通双因素ANOVA，随后进行Dunnett多重比较检验。对于Y-26732处理MSCs的细胞面积比较和γ-H2AX和Ki67的免疫荧光染色，使用非参数Mann-Whitney检验。使用Brown-Forsythe和Welch ANOVA检验进行DT和茜素红S定量的统计分析。

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