发育迟缓与肠道微生物组的持续性和可转移性改变相关

(PDF) Stunting is associated with persistent and transferable alterations in the gut microbiome

=====

在本研究中，我们评估了四组肠道微生物群的多样性和功能：（1）临床健康的幼儿（Normal_H，n = 3）；（2）营养不良/发育迟缓的幼儿（Stunted_H，n = 3）；（3）移植了来自发育迟缓幼儿的人类粪便微生物群（HFM）的无菌（Gn）猪仔（stunted Gn Pig，n = 8）；以及（4）移植了来自正常幼儿的人类粪便微生物群（HFM）的无菌（Gn）猪仔（normal Gn Pig，n = 11）。为了评估移植后的微生物群落组成，每组HFM Gn猪仔进一步分为两组，其中一部分猪仔在PTD7时被安乐死，其余在PTD23时被安乐死。值得注意的是，其中一个幼儿（6_CP04824）虽然被归类为发育迟缓（临床），但其肠道微生物群组成、多样性和功能与健康幼儿相似（图2和S2），因此我们将其数据排除在进一步的比较分析之外。

幼儿和HFM Gn猪的微生物群多样性

微生物群多样性是衡量社区中存在多少不同物种以及它们分布的均匀程度的指标。在肠道中，较低的多样性被认为是生态失调（微生物失衡）的标志。

α多样性指数 我们观察到健康和发育迟缓幼儿组之间在α多样性指数（考虑物种数量及其均匀度的Shannon指数，以及考虑存在的物种数量以及每个物种的相对丰度的Simpson指数）方面没有显著差异（图S1a）。然而，HFM移植导致正常HFM移植的Gn猪仔的大肠内容物中细菌种类的多样性显著更高（p<0.05），与移植发育迟缓HFM的Gn猪仔相比（图1）。因此，尽管在幼儿中未能检测到，但Gn猪仔的HFM移植揭示了正常与发育迟缓HFM样本中微生物组成的多样性显著更高或更高。

β多样性指数是衡量不同社区之间物种相似性或不相似性的指标。Bray-Curtis差异不仅考虑了每个样本的整体丰度（规模），还考虑了每个分类单元的丰度（形状）。该指数反映了不同样本中细菌群落组成和结构的差异。正常和发育迟缓幼儿之间在细菌物种的β多样性指数方面没有显著差异（图S1b），而Gn猪仔的大肠内容物和幼儿粪便细菌组成则存在显著差异（图2）。

幼儿和HFM Gn猪的微生物组成

尽管健康/正常与营养不良/发育迟缓幼儿在细菌多样性指数方面没有显著差异，但细菌组成存在明显差异。正常幼儿的粪便主要含有放线菌门（53-98%），其次是厚壁菌门（21-37%）和变形菌门（2-9%），而发育迟缓幼儿的粪便主要含有变形菌门（44-81%），其次是厚壁菌门（18-21%）和放线菌门（1-34%）（图S2a）。类似地，在移植了发育迟缓儿童粪便物质的Gn猪仔的大肠内容物中，变形菌门和厚壁菌门在PTD7时占主导地位，而在PTD23时厚壁菌门超过变形菌门。移植了正常儿童粪便的Gn猪仔的大肠内容物在整个实验过程中主要含有厚壁菌门（图3a）。因此，我们的HFM实验移植表明，除了放线菌门外，主要的门水平差异是可以传递且一致的。

在细菌类群方面（图3b），正常幼儿粪便中放线菌纲占主导地位，其次是芽孢杆菌纲，而发育迟缓幼儿粪便中γ-变形菌纲占主导地位，其次是芽孢杆菌纲。同样，γ-变形菌纲、梭菌纲和芽孢杆菌纲是HFM发育迟缓-Gn猪仔大肠内容物中最丰富的类群。另一方面，梭菌纲在HFM正常-Gn猪仔的大肠内容物中占主导地位，其次是γ-变形菌纲和芽孢杆菌纲。红螺菌纲和放线菌纲存在于HFM正常-Gn猪仔的大肠内容物中。尽管放线菌纲在正常幼儿粪便中丰富，但在Gn猪仔中的生长受到抑制。此外，梭菌纲在正常和发育迟缓幼儿中均未检测到；然而，在移植了HFM的Gn猪仔中，特别是HFM正常-Gn猪仔中，其丰度增加。

进一步，双歧杆菌科（53-98%）是正常幼儿粪便中最丰富的科，其次是肠球菌科（7-19%）和乳酸杆菌科（3-10%），而在发育迟缓幼儿中，肠杆菌科（44-80%）的细菌种类占主导地位，其次是双歧杆菌科、链球菌科、乳酸杆菌科（图S2b）。与发育迟缓幼儿的粪便样本类似，肠杆菌科（42-54%）的细菌种类在HFM发育迟缓-Gn猪仔的大肠内容物中最为丰富，其次是肠球菌科（14-21%）、梭菌科（9-14.4%）、葡萄球菌科（1.5-11%）、毛螺菌科（2-5%）和瘤胃球菌科（2-5%），双歧杆菌科无法检测到。HFM正常-Gn猪仔的大肠内容物主要含有肠杆菌科（17-32%）的细菌种类，其次是毛螺菌科（19-22.5%）、肠球菌科（12-20.7%）、红螺菌科（4-11.4%）、葡萄球菌科（7%）、梭菌科（5-8%）和瘤胃球菌科（4.5%）的细菌种类，双歧杆菌科仅占4.8%（图3c）。

在属的水平上，双歧杆菌（53-98%）和肠球菌（7-19%）在健康/正常幼儿的粪便中占主导地位，而在发育迟缓幼儿中，克雷伯氏菌（32-80%）、双歧杆菌（1-34%）、链球菌（1-18%）和乳酸杆菌（0.5-8%）是最丰富的属（图S2c）。正常幼儿的肠道微生物群主要为长双歧杆菌，而肺炎克雷伯菌在发育迟缓幼儿中占主导地位（图S2d）。Gn猪仔中的细菌属更为多样，克雷伯氏菌（29-45%）和大肠杆菌（17-32%）属在发育迟缓-Gn猪中占主导地位（图3d）。接下来是梭菌属（15-25%；17-22%）、肠球菌属（14-21%；12-21%）和葡萄球菌属（1.5-11%；0.6-7%）。虽然双歧杆菌在正常幼儿粪便中丰富，但其在移植了HFM的Gn猪的大肠中的生长受到抑制。类似地，发育迟缓幼儿粪便中存在的乳酸杆菌和双歧杆菌在Gn猪中的生长也受到抑制。总体而言，与正常幼儿相比，发育迟缓幼儿粪便微生物群的细菌组成在Gn猪的大肠内容物中更为明显。

移植到Gn猪模型后的人类粪便微生物群落组成

幼儿粪便微生物群的独特核心属揭示了营养不良/发育迟缓幼儿中有8个独特属（棒状杆菌属、韧乳酸杆菌属、变形杆菌属），健康/正常幼儿中有19个，8个在两组中重叠（图S3a）。在正常幼儿和HFM Gn猪之间共享但在发育迟缓幼儿和粪便HFM Gn猪之间未共享的属包括双歧杆菌属、肠球菌属、地中海杆菌属、志贺氏菌属和柠檬酸杆菌属（图4c，e）。只有乳酸植物杆菌属和弯曲乳酸杆菌属定植在发育迟缓幼儿移植的Gn猪中，而不在正常幼儿移植的Gn猪中（图4e）。

大量来自正常幼儿粪便（n = 36）和发育迟缓幼儿粪便（n = 32）的细菌物种定植在HFM Gn猪的大肠内容物中（图5a）。然而，我们还观察到在移植了正常（n = 24）和发育迟缓（n = 27）幼儿粪便的Gn猪仔的大肠内容物中有几个细菌物种在原始粪便样本中未检测到（图5a）。通过LDA效应大小（LEfSe）比较核心OTUs，确定了3个和7个物种在正常和发育迟缓幼儿队列之间具有显著差异，绝对LDA得分>2.5（图S3b）。此外，通过LEfSe（LDA得分>2.8）比较核心OTUs，分别确定了15、13和8个特征在正常幼儿、发育迟缓幼儿和HFM接种的Gn猪仔之间具有显著差异（图5b）。嗜热链球菌和乳酸植物杆菌属（LDA > 3.6）在正常幼儿粪便中高度富集，而肺炎克雷伯菌和乳酸杆菌属（LDA > 4.2）在发育迟缓幼儿中高度富集。在Gn猪仔中富集的8个物种中（LDA > 4.0），毛螺菌科_u_s和粪肠球菌（LDA > 4.8）高度富集，其次是屎肠球菌（LDA 4.7）和产气荚膜梭菌（LDA 4.6）（图5b）。值得注意的是，无论是幼儿还是Gn猪仔中富集的大多数物种都是属于致病菌种的细菌。同样，我们观察到在正常幼儿中丰富的许多有益共生菌（例如双歧杆菌）在Gn猪仔中与致病菌如肠球菌和大肠杆菌相比未能很好地建立（图5c）。在发育迟缓队列中也观察到了类似的细菌物种模式（图5c）。

在幼儿和HFM Gn猪中鉴定的细菌毒力因子和抗生素耐药基因

毒力因子 - 病原体中的毒力因子参与感染的各个阶段，包括毒素产生、定植、粘附和侵袭，以及在宿主细胞内的存活。肠道细菌毒力因子对肠道感染有复杂的影响。这些相互作用的确切机制尚不清楚；然而，细菌毒力因子可能通过资源竞争、免疫反应调节、肠道屏障功能改变和毒素产生来影响胃肠道感染。我们使用VFDB（毒力因子数据库）分析幼儿和Gn猪微生物组中的毒力因子，不针对特定病原体，而是旨在广泛比较各组之间的毒力潜力。在正常和发育迟缓幼儿粪便中观察到的细菌毒力因子组成相似（鼠疫耶尔森菌和弗莱克斯纳志贺菌毒力因子仅在发育迟缓幼儿中存在）（图6a和图S4a）。然而，这两组幼儿之间的这些因子的相对丰度显著不同，正常幼儿粪便中以奇异变形杆菌和大肠杆菌毒力因子为主，而发育迟缓幼儿粪便中以鼠疫耶尔森菌和奇异变形杆菌毒力因子为主（图S4a）。对正常和发育迟缓幼儿中富集的毒力基因进行分析表明，两组中富集的大多数基因来自致病菌（图S4b）。在HFM Gn猪中，我们观察到与原始接种物相似的模式，表明毒力因子可以轻松从人类粪便微生物群转移到Gn猪。富集毒力基因的分析（基于LDA > 2.5）显示，正常/健康幼儿[10]比发育迟缓幼儿[6]和HFM Gn猪仔[5]拥有更多的富集毒力基因（图6b；表1）。正常幼儿粪便中富集程度最高的前5个毒力基因（LDA > 3.5）包括肺炎克雷伯菌tnpA、粘质沙雷氏菌orfA、大肠杆菌stbA和柠檬酸杆菌orf39/41，而在发育迟缓幼儿粪便中，仅有鼠疫耶尔森菌基因（irp1、irp2 ybtU、fyuA和ybtE）位于前5个高度富集基因（LDA > 4.0）。粪肠球菌和大肠杆菌基因是HFM发育迟缓-Gn猪仔大肠内容物中在PTD23时唯一高度富集的细菌毒力基因，而仅产气荚膜梭菌基因在PTD7时富集（LDA > 4.0）。大肠杆菌（AAC6-Ib、tnpR、OXA-1）、粪肠球菌（ermB）和金黄色葡萄球菌（33390919）基因在HFM正常-Gn猪仔中在PTD7时高度富集（LDA > 3.0），而酿脓链球菌（52345264）、大肠杆菌（stbA、traA）和粪肠球菌（32470452、32470456）基因是在该队列中在PTD23时前5个高度富集的毒力基因（图6b；表1）。

值得注意的是，与原始接种物中检测到的毒力因子相比，移植了正常/发育迟缓幼儿粪便的Gn猪的大肠内容物中富集的细菌毒力因子较少。此外，HFM Gn猪组中富集的毒力基因大多来自致病菌（表1）。只有粪肠球菌和产气荚膜梭菌的毒力基因在HFM发育迟缓-Gn猪的大肠内容物中最为富集。这些细菌已被证明携带对多种抗生素的耐药基因，正如在AMR分析中观察到的那样（图7）。

抗生素耐药性（AMR）– 我们的数据表明，携带抗生素耐药基因的细菌数量，发育迟缓儿童（N = 15）比正常儿童（N = 8）多（表1），这表明发育迟缓儿童可能反复或长时间接受了抗生素治疗。有趣的是，发育迟缓幼儿中的这些AMR耐药细菌在移植到Gn幼崽时的转移性较差，相比于在正常幼儿粪便中鉴定出的那些。

正常和发育迟缓幼儿之间的AMR类别和基因组成相似；然而，我们观察到这些组别之间相对丰度的显著差异（图S5a）。正常幼儿的粪便中主要是对四环素和大环内酯-林可胺-链阳菌素B类抗生素耐药的细菌，而发育迟缓幼儿的粪便中主要是对磺胺类和氨基糖苷类抗生素耐药的细菌（图S5a）。这些主要类别在HFM Gn幼崽中得以建立；然而，它们的丰度和比例有所不同。HFM发育迟缓-Gn幼崽的大肠内容物中喹诺酮类和氟喹诺酮类（22-42%）、磺胺类（10-26%）和氨基糖苷类（12.6-13.6%）耐药细菌富集（图7a）。而HFM正常-Gn幼崽中主要是对多粘菌素（15.4-21.6%）、大环内酯-林可胺-链阳菌素B（17%）和磺胺类药物（15-16%）耐药的细菌。值得注意的是，对利福平和糖肽类耐药的细菌只存在于HFM正常-Gn幼崽中，尽管这些AMR类别在原始接种物中无法检测到。

携带氨基糖苷类和磺胺类耐药基因的细菌在发育迟缓幼儿的粪便和HFM发育迟缓-Gn幼崽中占主导地位（图7b；表1）。耐四环素、大环内酯类、A类β-内酰胺酶和多粘菌素_Colistin耐药的细菌也在发育迟缓儿童粪便中富集，并可转移到Gn幼崽。相比之下，正常幼儿粪便中主要是对磺胺类耐药的细菌，其次是氨基糖苷类、四环素类、多粘菌素_Colistin和大环内酯类耐药的细菌。尽管携带四环素和多粘菌素_Colistin耐药基因的细菌在发育迟缓幼儿中较少，但HFM发育迟缓-Gn幼崽的大肠内容物中携带这些抗生素耐药基因的细菌丰度较高（图7b；表1）。通过线性判别分析效应大小（LEfSe）比较细菌AMR基因，鉴定了8、15、14和4个AMR基因在正常幼儿、发育迟缓幼儿、HFM正常-Gn幼崽和HFM发育迟缓-Gn幼崽之间显著区分，绝对LDA得分>3.5（图S6）。这些对比发现表明，各种宿主因素可能会影响微生物群落组成和多样性。

存在于幼儿粪便和HFM Gn猪大肠内容物中的细菌的功能特征

在这里，我们总结了正常和发育迟缓幼儿粪便中存在的肠道微生物群以及移植了幼儿微生物群的Gn猪大肠内容物之间的功能相似性和差异（图8a和图S7a）。分析的肠道微生物群功能包括碳水化合物活性酶（CAZymes）、代谢途径、蛋白家族（pfam）、酶委员会（EC）和基因本体（GO）术语。总体而言，功能分析显示，发育迟缓幼儿粪便中涉及碳水化合物生物合成的酶和与蛋白质/氨基酸、碳水化合物和脂肪分解代谢相关的代谢途径高度富集（图S7），而正常幼儿粪便中涉及碳水化合物降解的酶和合成代谢途径富集（图8和图10）。总体上，在HFM Gn猪中观察到了类似的趋势。由于营养不良/发育迟缓幼儿相较于健康幼儿的已知细菌种群中许多有益成员的减少，我们推测这些微生物群落的碳水化合物生物合成细菌功能的富集是为了能够利用营养不良/发育迟缓幼儿饮食中有限的营养（图8b）。总体而言，我们观察到，在健康幼儿中，肠道细菌会降解膳食碳水化合物，为宿主提供能量并支持细菌生长（合成代谢）。而在发育迟缓幼儿中，肠道细菌会从有限资源中获取能量（分解代谢）并合成结构性碳水化合物（生物合成）以生存，扰乱宿主的能量平衡。

碳水化合物活性酶（CAZymes）在构建和分解复杂的碳水化合物和糖缀合物（如纤维素、半纤维素和淀粉）方面至关重要。基于氨基酸序列相似性，这些酶被分为糖苷水解酶（GHs）、糖基转移酶（GTs）、多糖裂解酶（PLs）、碳水化合物酯酶（CEs）以及非酶类碳水化合物结合模块（CBMs）和辅助活动（AAs）。碳水化合物活性酶（CAZymes）分析显示，涉及碳水化合物生物合成（GTs）的微生物群落酶在发育迟缓幼儿的粪便中丰富（图S7a和图9a），表明肠道中能量供应有限且底物多样性低；而涉及碳水化合物降解（GHs）的酶在健康/正常幼儿的粪便中丰富，反映了在营养丰富的环境中代谢复杂碳水化合物的更高多样性和能力（图S7a和图9a）。在HFM Gn猪中也观察到了类似的趋势（图9a）。当我们进行LEfSe分析时，得到了类似的结果；其中GT2在发育迟缓幼儿中高度富集，而GH29在健康幼儿中富集（图9b）。

细菌代谢途径由一系列酶促反应组成，这些反应在达到最终产物之前多次改变底物。这包括分解代谢（将复杂的大分子分解为其基本成分以获取能量）和合成代谢（利用简单分子和能量形成新产物）。与CAZymes结果相反，我们观察到在营养不良/发育迟缓幼儿的粪便中，高度富集的代谢途径涉及分解代谢，而涉及合成代谢的途径在健康/正常幼儿的粪便中富集（图S7）。然而，这些趋势在HFM Gn猪中逆转，其中生物合成途径在移植了发育迟缓幼儿粪便的Gn猪的大肠内容物中富集，而降解代谢途径在移植了健康/正常幼儿粪便的Gn猪中富集（图10和图S8）。

图8 各组内（a）和各组间（b）富集的细菌功能特征数量总结

(全文结束)