循环细胞外囊泡的蛋白质组及其对血小板的功能影响因分离方法而异

The proteome of circulating extracellular vesicles and their functional effect on platelets vary with the isolation method

摘要：细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中起关键作用，并作为多种病理中的生物标志物来源。本研究旨在表征通过超速离心（UC）或尺寸排阻色谱法（SEC）分离的血浆来源EVs，以确定最适合进行蛋白质组学和功能研究的方法。EVs的表征包括纳米粒子追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、通过Western blot检测生物标志物以及定量蛋白质组学分析。与UC-EVs相比，SEC-EVs样品具有更高的颗粒和蛋白质浓度、颗粒与蛋白质的比例更高且尺寸更小。通过顺序窗口采集所有理论质谱（SWATH-MS）分析共鉴定出171种蛋白质，其中11种在SEC-EVs中增加，5种在UC-EVs中增加。UC-EVs中增加的蛋白质是补体蛋白和免疫球蛋白，而SEC-EVs中增加的蛋白质是载脂蛋白和存在于细胞外空间的蛋白质。使用来自活化血小板的EVs进行的功能研究表明，通过SEC分离的EVs加剧了血小板聚集，而UC-EVs没有诱导任何效果。这表明与通过UC获得的EVs相比，通过SEC获得的EVs似乎更适合用于血小板相关的功能研究。本研究结果为涉及血浆来源EVs的未来临床导向研究铺平了道路。

引言：细胞外囊泡（EVs）是一组异质性的30至1000纳米球形纳米颗粒，由细胞分泌，含有蛋白质、脂质、RNA和DNA，并被脂质双层包裹。1946年，Chargaff和West首次描述了他们称之为“极高颗粒重量的脂蛋白”的促凝活性，这些脂蛋白是从强离心场（31,000 g）后的沉淀中获得的。几年后，Peter Wolf将这些富含脂质的颗粒称为“血小板尘埃”，因为它们的凝血特性和从血小板释放。2012年，国际细胞外囊泡学会（ISEV）成立，2014年发布了首个MISEV指南。许多术语被用来指代EVs，根据其起源、性质和功能，如外泌体、微泡、外体、微粒或凋亡小体。然而，由于无法获得每种类型EVs的纯群体，2018年MISEV指南认可“细胞外囊泡”作为从细胞释放并被脂质双层限制且不能复制的颗粒的通用术语。指南提出了根据大小、密度、分子组成和/或细胞来源的EVs亚型术语。根据大小，EVs可分为小（sEVs）和中/大EVs（mEVs，lEVs）；根据密度，可分为低、中或高密度；EVs还可以根据其分子组成（特定分子的存在）分类；最后，根据细胞来源，如果起源于多泡体（MVB），则称为外泌体，如果起源于细胞膜通过外翻，则称为外体（已知为微粒、微泡）。

结果：SEC-EVs样品的EVs产量更高、尺寸更小，颗粒与蛋白质比例更大，与UC-EVs样品相比。为了评估由于分离方法导致的EVs特征差异，我们从每个供体中通过两种方法分离它们，即UC和SEC。为了确认EVs的完整性和圆形形态，通过透射电子显微镜（TEM）观察通过UC和SEC分离的EVs。此外，通过NTA分析了EVs的浓度和尺寸。SEC-EVs的颗粒浓度为6.91 × 10^9 (4.61 × 10^9 − 1.14 × 10^10) 颗粒每毫升无血小板血浆（PFP），显著高于UC-EVs的颗粒浓度（3.75 × 10^8 (2.83 × 10^8 – 6.94 × 10^8) 颗粒/PFP mL）（p = 0.0005）。这也与TEM图像一致。与UC-EVs相比，SEC-EVs更小，平均直径为154.24 ± 18.37 nm，众数为116.65 (105.70 – 122.31) nm，而UC-EVs的平均直径为202.93 ± 18.42 nm，众数为157.10 (136.08 – 180.66) nm（分别为p < 0.0001和p = 0.0024）。SEC-EVs的蛋白质浓度（1.06 ± 0.66 mg/mL）高于UC-EVs样品（0.46 ± 0.22 mg/mL）（p = 0.0448）；而SEC-EVs样品的颗粒与蛋白质比例（1.13 × 10^9 ± 8.01 × 10^8 颗粒/µg）也高于UC-EVs（7.83 × 10^7 ± 3.29 × 10^7 颗粒/µg）（p = 0.0224）。

通过SWATH-MS分析鉴定了16种在UC和SEC分离方法之间差异丰度的蛋白质，而DDA分析允许对所有鉴定的蛋白质进行功能表征。为了分析两种EVs分离方法之间的蛋白质组差异，使用了两种不同且互补的液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）方法，一种是通过数据依赖采集（DDA）模式进行的定性分析，另一种是通过顺序窗口采集所有理论质谱（SWATH-MS）进行的高通量和无标记定量分析。为了全面了解所分析的两类样品，使用主成分分析（PCA）进行了无监督的多变量统计分析，两个组完美聚类，达到83.9%。通过SWATH-MS分析共鉴定和量化了171种蛋白质，ppm为30，错误发现率（FDR）为1%。火山图分析显示，在SEC-EVs和UC-EVs之间存在16种差异表达（p < 0.05）的蛋白质，最小倍数变化（FC）为2。在这些蛋白质中，11种在SEC-EVs组中表现出较高丰度，5种在UC-EVs组中更为丰富。除了火山图分析外，我们还对16种差异蛋白质进行了热图聚类分析，描绘了标准化丰度的Z分数，蛋白质排列在行中，样品排列在列中。分析确定了两个主要簇，与两种分离方法匹配。

验证研究证实了蛋白质组数据：C3在UC-EVs样品中上调，而APOC4下调。SWATH-MS结果在一个独立的6名供体队列中通过Western blot进行了验证。我们专注于验证在蛋白质组分析中比较的两组中普遍存在的两种蛋白质：补体C3（CO3），在UC-EVs中上调，以及载脂蛋白C4（APOC4），在SEC-EVs中上调。因此，证实了CO3和APOC4在UC-EVs和SEC-EVs中分别更丰富（p = 0.0312，两者均如此），与SWATH-MS数据一致。

SEC-EVs在不同条件下增强血小板聚集，而UC-EVs没有效果。为了评估EVs对血小板的功能影响，我们进行了血小板聚集实验，将血小板与通过UC和SEC分离的活化富含血小板血浆（PRPa）衍生的EVs一起孵育。血小板活化诱导EVs释放，这与从PRPa分离的EVs数量增加相比未活化的PRP一致（p = 0.0068；通过SEC分离的EVs）。由于从单个供体的PRPa中通过UC分离的EVs产量较低，我们首先使用SEC-EVs建立了功能实验的实验条件。血小板（2.5 × 10^8 血小板/mL）与SEC-EVs以1:100的比例在37°C下孵育15-25分钟，然后进行血小板活化。添加血小板激动剂后，测量血小板聚集5分钟。使用凝血酶（0.05 U/mL和0.1 U/mL）和胶原蛋白（10 µg/mL和40 µg/mL）分别通过PAR-1/4受体和GPVI受体信号通路诱导血小板聚集。虽然SEC-EVs在预孵育时间为15分钟时对0.05 U/mL凝血酶诱导的血小板聚集没有效果，但当孵育25分钟时，EVs增强了血小板聚集（86.92 ± 4.72% 对比71.75 ± 7.99%，无EVs；p < 0.0001）。此外，当用0.1 U/mL凝血酶诱导血小板聚集时，EVs处理增加了聚集水平，在15和25分钟的EVs孵育时间下（分别为p = 0.0019和p = 0.0042）。关于胶原蛋白诱导的血小板聚集，EVs仅在较低浓度的胶原蛋白（10 µg/mL）下增加了聚集。在这种情况下，EVs在孵育15分钟后使血小板聚集增加了12.78 ± 11.73%（p = 0.0178），在孵育25分钟后增加了14.88 ± 8.82%（p = 0.0020），相较于单独使用胶原蛋白。然而，在较高浓度的胶原蛋白（40 µg/mL）下，EVs未能增加血小板聚集，与对照组相比。

讨论：本研究为血小板功能研究提供了指南，并比较了两种主要的EVs分离方法的数据：UC和SEC。还提供了通过这两种方法分离的EVs的比较蛋白质组学研究。近年来，新的EVs角色在几种病理生理过程中出现，鉴于EVs在组织内和组织间的细胞间通讯中的作用。这一EVs功能使其成为多种病理不同阶段的重要生物标志物来源。此外，它们存在于血液等生物流体中，使得它们可通过非侵入方式用于多种疾病的诊断和预后。然而，这些生物流体包含不仅仅有EVs，还包括可溶性蛋白质、细胞或脂蛋白，因此分离方法是一个关键步骤。后者需要考虑几个参数，如分离效率、EVs纯度、可重复性、可扩展性和总体成本。任务的复杂性导致开发了几种EVs分离协议，每种协议都有不同的特点。在本研究中，我们通过NTA、TEM、Western blot、蛋白质组学和功能性血小板聚集实验对通过两种最常用的方法（SEC和UC）分离的血浆衍生EVs进行了比较。

结论：总之，本研究表明，血浆衍生EVs的特性取决于分离方法，与UC-EVs相比，SEC-EVs样品具有更高的颗粒和蛋白质浓度以及颗粒与蛋白质比例，且尺寸更小。与此一致，UC和SEC协议都不能有效分离不同的EVs亚型，尽管在sEVs方面有所富集，特别是在SEC样品的情况下。关于蛋白质组概况，虽然相似，但也存在一些相关差异，UC-EVs样品中补体蛋白和免疫球蛋白的含量增加，而SEC-EVs中载脂蛋白的含量增加。使用血浆衍生的EVs和不同激动剂（如凝血酶或胶原蛋白）进行的血小板聚集实验表明，通过SEC获得的PRPa衍生的EVs可以增加血小板反应性，而通过UC获得的EVs则不会。我们的数据为未来涉及EVs的临床导向功能研究铺平了道路。

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