推进细胞外囊泡生产：利用3D细胞培养提高生理相关性和产量

(PDF) Advancing Extracellular Vesicle Production: Improving Physiological Relevance and Yield with 3D Cell Culture

细胞外囊泡（EVs）是细胞间通信的重要介质，在早期疾病生物标志物和治疗剂方面具有巨大潜力。它们存在于血液等生物液体中，可从液体活检中检测到，用于多种诊断和治疗应用。然而，患者样本的可用性往往有限。为了解决这一问题并深入了解体内疾病机制，研究人员开始利用体外细胞培养模型研究EV的分子特征并进行高通量分析。尽管传统的2D细胞培养在过去几十年中一直是细胞生物学研究的标准工具，但因其更接近体内环境而逐渐成为一种更具生理相关性的体外工具。然而，目前缺乏系统比较3D与2D细胞培养对EV生产和分析影响的文献。本综述通过整合多项主要研究，首次全面评估了3D与2D细胞培养模型对EV生产、货物和功能的影响。

2. 对比2D与3D细胞培养收集的EV特性

以下部分按3D细胞培养模型分类（图1绿色框），首先介绍无支架的球状体模型，然后是有支架的方法，进一步分为水凝胶、刚性支架和生物反应器系统。

2.1 无支架3D模型：球状体

2.1.1 低吸附培养板和培养皿

低吸附（也称为非贴壁）培养板通过防止细胞附着于表面，促进细胞聚集形成3D球状体。这些培养板通常涂有亲水性聚合物，如聚-HEMA，以减少蛋白质和细胞附着。低吸附培养容器的主要优点包括低成本、易于实施和促进细胞间粘附，使其特别适用于模拟体内条件。然而，实验方案通常需要离心，这可能引入剪切应力并导致细胞损伤。较大的球状体还可能出现氧气和营养扩散受限的问题，从而导致坏死核心。此外，这些系统缺乏支架模型中的细胞外基质（ECM）成分，也不具备生物反应器提供的动态培养条件，因此在生理相关性上不如更先进的3D培养系统。

2.1.1.1 非贴壁微孔板

一项研究比较了使用超低吸附（ULA）96孔板培养的PANC-1胰腺癌细胞3D球状体与24孔板培养的2D单层细胞产生的EV。球状体通过离心细胞悬液并在旋转摇床上孵育24小时形成。24小时后，保留紧凑的球状体并丢弃松散的聚集体。第5天，从两种模型中收集条件培养基（补充有10%去除外泌体的胎牛血清（FBS）），离心去除碎片，并使用商业试剂盒和220纳米过滤分离外泌体。

透射电子显微镜（TEM）显示，EV主要分布在40至150纳米之间，但未评估2D和3D条件下尺寸分布的差异。TEM和RNA选择性染色荧光成像均显示，3D球状体分泌的EV显著更多（图2A）。定量实时PCR（qRT-PCR）分析了2D细胞、3D球状体及其相应外泌体中的六种特定miRNA（图2B）。外泌体中的miRNA表达始终高于亲代细胞。在外泌体miRNA中，miR-96在2D和3D培养之间没有显著差异，miR-4454在3D衍生的外泌体中显著较低，而miR-1246、miR-21、miR-17-5p和miR-196a在3D衍生的外泌体中显著富集。通过总外泌体RNA和蛋白质分离试剂盒提取并量化外泌体和亲代细胞中的蛋白质，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量Glypican-1（GPC-1）水平。来自3D球状体的外泌体表现出GPC-1水平增加了4倍，高于2D培养的外泌体及2D和3D亲代细胞，表明3D培养环境可能增强外泌体分选机制（P < 0.001）（图2C）。

总体而言，这种3D无支架培养生成的球状体分泌了更多的EV，富含特定的基因组和蛋白质组货物，为理解疾病机制和途径提供了宝贵的见解。支持非贴壁96孔板增加EV产量的研究发现，将骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）培养在涂有聚-HEMA的96孔板上，到第5天时EV产量比2D培养增加了两倍以上（p < 0.001）。

相比之下，一项比较BM-MSCs在非贴壁96孔板中2D和3D培养的研究发现，3D模型并未增强EV的产量、形态或货物。EV在这两种条件下相当，2D衍生的EV显示出更高的蛋白质多样性。有趣的是，3D衍生的EV表现出促炎和促纤维化作用，表明其治疗潜力降低。缺乏EV增强可能是由于在接种细胞后仅24小时就切换到无血清培养基，这可能限制了球状体的成熟。此外，高细胞接种密度（每孔2.5 × 10⁴个细胞）可能损害了球状体内部的营养和氧气扩散，减少了深部球状体细胞的存活率和EV分泌。

2.1.2 悬滴法

悬滴法涉及将小滴细胞悬液倒置放置在盖子或平面上，利用重力和表面张力促进细胞聚集和球状体形成。通过对液滴体积和细胞密度的调整，可以精确控制球状体大小，实现均匀聚集体的可重复形成。该技术成本低廉，无需特殊设备，适合中等通量应用。然而，它缺乏ECM成分和动态培养条件，可能会限制生理相关性。此外，培养基更换技术上具有挑战性且劳动密集，使其不适合长期或大规模研究。

评估了BM-MSCs在3D悬滴（HD）培养系统与单层培养瓶中产生的EV差异。BM-MSCs在含有10%去除外泌体FBS的培养基中生长，使用沉淀法分离外泌体。通过Nanodrop仪器测量外泌体蛋白浓度并归一化到1 × 10⁵个细胞来量化外泌体分泌。第5天细胞培养时，3D HD细胞每个细胞分泌的外泌体显著多于2D培养的细胞，增加了两倍（p < 0.01）。虽然不同培养条件下的外泌体产量存在显著差异，但未评估其他EV特性。

2.2 基于支架的3D模型：水凝胶

水凝胶是能够保留水分并模拟ECM的交联聚合物网络，提供结构支持、生化信号和受控质量传输，与依赖细胞间相互作用的无支架模型不同。它们的成本低、制造容易，并且材料组成灵活，包括天然（如胶原蛋白、藻酸盐）和合成（如PEG、PAA）聚合物，使其广泛应用于体外模型。水凝胶可以通过调整交联密度、pH值和温度等参数来调节硬度、孔隙率和降解速率，从而适应不同的组织类型。它们还支持可溶性因子的扩散以促进细胞生长。然而，缺点包括机械强度有限、难以实现均匀孔径以及不适合承重组织。

2.2.1 胶原蛋白

基于胶原蛋白的水凝胶因生物相容性、生物降解性和模拟天然ECM的能力而在癌症和组织工程模型中得到广泛应用。作为主要的ECM蛋白，胶原蛋白通过细胞-基质相互作用支持细胞粘附、迁移和信号传导，特别适用于建模肿瘤微环境。其机械性能、孔隙率和纤维密度可以通过调整浓度、pH值、温度和离子强度等参数进行调节。然而，作为一种动物来源的天然材料，胶原蛋白存在批次变异性、病原体传播风险的隐患，其有限的硬度和稳定性可能限制其在长期或承重应用中的使用。为了模拟肿瘤ECM，一项研究使用胶原-透明质酸（Col1-HA）支架培养尤文肉瘤（ES）细胞，并将这种3D组织工程（TE）模型产生的外泌体与2D Col1-HA涂层板、聚丙烯管中3D球状体和患者血浆产生的外泌体进行了比较。细胞培养7天，第3天和第7天收集培养基以分离外泌体。

NTA显示，Col1-HA支架中的外泌体分布更密集且尺寸更小，类似于患者血浆衍生的外泌体（图4A）。平均外泌体模式尺寸分别为103.3 nm（2D培养）、76.7 nm（Col1-HA支架）和70 nm（人血浆），表明3D结构、支架组成或两者共同影响外泌体尺寸。进一步与聚丙烯中的3D球状体和基质涂层板上的单层培养进行比较，发现这两个系统均未能复制天然外泌体尺寸，强调了3D架构和基质组成对于模拟生理外泌体特性的必要性。

该研究检查了外泌体货物差异，重点关注Polycomb组蛋白甲基转移酶EZH2 mRNA，这是ES肿瘤生长和进展的关键介质。通过qRT-PCR对细胞和外泌体中的RNA进行分析，结果显示Col1-HA支架衍生的外泌体EZH2 mRNA水平高于2D培养，与患者血浆中观察到的水平一致（图4B）。这些发现表明，Col1-HA模型产生的外泌体可作为潜在的ES生物标志物，突出了其在EZH2 mRNA富集中的作用，并强化了在癌症研究中使用类似天然实验模型的重要性。尽管Western blot分析显示Col1-HA TE肿瘤中EZH2蛋白增加，但在2D培养中未检测到EZH2蛋白，未评估外泌体蛋白质组学货物。

最后，该研究考察了Col1-HA肿瘤细胞通过外泌体向骨龛MSC传递EZH2 mRNA的能力。经过12小时，标记的外泌体被hMSC内化，显著增加了EZH2 mRNA水平，相比未经处理的hMSC或用hMSC衍生的外泌体处理的hMSC。这些外泌体还影响了人成骨细胞（hOBs）和破骨细胞（hOCs）：虽然这两种细胞类型都内化了外泌体，但hOBs中的EZH2水平保持不变，而hOCs中的EZH2水平下降。这些发现表明，Col1-HA支架衍生的富含EZH2 mRNA的外泌体可以传递给各种骨龛细胞并产生不同的效果，尽管未与2D细胞培养进行比较。

2.2.2 琼脂糖

琼脂糖是从红藻中提取的一种天然多糖，因其可逆的温敏凝胶化、机械稳定性和低细胞毒性而在生物医学应用中受到重视。与支持细胞粘附的胶原蛋白不同，琼脂糖作为一种非粘附性支架，通过促进细胞间相互作用和保持天然细胞形态来支持球状体形成。其多孔结构允许营养物质扩散，其性质可以通过化学修饰进行调节。然而，天然琼脂糖存在一些局限性，包括对复杂生物环境的适应性差、高凝胶化温度和缓慢降解，限制了其在动态或长期系统中的使用。为了评估其在EV研究中的实用性，一项研究比较了人胃癌（hGC）细胞（MKN45和MKN74）在2D T175烧瓶与琼脂糖水凝胶微孔阵列中的EV生产。在2D培养中，细胞生长至60-70%汇合度后切换到去除EV的培养基48小时。在3D培养中，细胞接种到定制的琼脂糖水凝胶微孔阵列中，培养一天，然后在去除EV的培养基中维持六天。通过差速离心从两种条件的条件培养基中分离EV。

使用TEM和NTA分析EV的尺寸和浓度，显示3D培养的EV尺寸较小（85 - 135nm），比2D培养（100 - 180 nm）的EV更小。当归一化到细胞数量时，3D培养每个细胞产生的EV显著更多：每MKN45细胞1020个EV，每MKN74细胞1656个EV，而2D培养分别为636和365个EV。成像流式细胞术证实了两种模型中外泌体标记物CD9、Flotillin-1和CD81的表达，其中CD9在3D衍生的EV中显著更高。这些发现表明，3D条件下培养的hGC细胞更高效地生产EV，同时保持外泌体标记物表达并展示出独特的特性。

使用miRNA特异性分离试剂盒从细胞和EV中提取RNA，qRT-PCR显示3D培养的miRNA谱较2D培养更为丰富。在3D衍生的EV中发现了164个miRNA，在2D衍生的EV中发现了104个miRNA，其中有10个仅存在于3D衍生的EV中，4个独特存在于2D衍生的EV中。对3D衍生EV中独有的10个miRNA进行过表达分析，发现它们在疾病状态相关通路中显著富集，包括淋巴瘤和炎症反应，表明它们在这些生物过程中的潜在作用。此外，对3D衍生EV中的164个miRNA进行基因集富集分析，确定了关键的癌症相关信号通路，包括p53、MAPK、TGF-β和RAS，进一步强调了它们与癌症相关机制的关联。

使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对2D和3D培养的EV进行蛋白质组学分析，共鉴定出430种蛋白质。无监督层次聚类显示，EV起源（MKN45和MKN74）和培养条件（2D和3D）强烈影响蛋白质组学货物，根据这些变量形成了不同的簇。对2D和3D-EVs中最显著差异表达的20种蛋白质进行监督聚类，发现其中17种蛋白质在3D-EVs中表达下降，表明3D条件下整体蛋白质下调。蛋白质集富集分析突显了3D培养EV中ARF6信号通路蛋白的显著下调，表明膜运输和外泌体生物发生的变化。

评估了EV与受体细胞的关联及其对侵袭性的影响。将2D和3D MKN45培养的PKH26标记的EV与MCF10A和MKN45细胞共孵育长达30分钟。流式细胞术显示，3D衍生的EV在前15分钟内的摄取量更大，表明早期相互作用增强。使用Matrigel腔室进行的侵袭实验表明，与2D衍生的EV处理的细胞相比，3D衍生的EV显著增加了细胞的侵袭能力，表明更强的促侵袭效应。

在琼脂糖水凝胶中培养的细胞每个细胞产生的EV显著更多，尺寸更小，富含与癌症相关的miRNA，并表现出ARF6通路蛋白下调。这些EV还展示了更强的受体细胞关联和增加的侵袭潜力，突显了其在基于EV的治疗和疾病建模中的相关性。类似的研究比较了脐带Wharton胶中的间充质干细胞（UC-MSCs）在琼脂糖微孔和单层培养中的EV生产。虽然未进行全面的EV产量、基因组学和功能分析，但研究报告了2D和3D-EVs之间的形态特征和蛋白质数量相似。值得注意的是，3D衍生的EV富含靶向和定位相关的蛋白质。另一项使用琼脂糖微孔评估人脂肪源性干细胞EV生产的研究报告称，与单层培养相比，EV产量增加了约三倍，EV尺寸略有增加。球状体衍生的EV富含伤口愈合miRNA（例如miRNA-21-3p）和EV生物发生基因（例如CD82），并表现出优越的血管生成和伤口愈合效果，在糖尿病大鼠模型中实现了最高程度的伤口闭合。

2.2.3 肽

肽水凝胶是由短肽序列组成的合成自组装材料，形成类似ECM的纳米纤维网络。通常通过pH值或盐诱导的超分子相互作用组装而成，它们提供了理想的可调性质，适合3D细胞培养。商业配方如PuraMatrix™、PGmatrix™和HydroMatrix™基于两亲性肽，自组装成具有纳米级孔径的β片结构，支持软组织应用。其主要优势在于设计灵活性，因为机械性能、孔隙率和生物活性可以通过肽序列修改进行精确控制。与天然水凝胶（胶原蛋白、琼脂糖、藻酸盐、Matrigel™）不同，肽水凝胶允许独立调节生化和机械性质，提供更大的控制能力和增强的可重复性。然而，它们通常昂贵，可能缺乏长期机械稳定性，并且不太适合涉及高度收缩性细胞或大规模应用的培养。为了探索其在EV研究中的实用性，一项研究比较了宫颈癌细胞在2D烧瓶和3D肽水凝胶中多个时间点的EV生产。3D培养使用肽PGmatrix™水凝胶进行，细胞嵌入后维持在24孔板中。两种条件下的细胞均在含10%去除外泌体FBS的培养基中生长，通过差速离心和220纳米过滤在定义的时间点收集EV，水凝胶样品在离心前机械破坏。使用Qiagen ExoRNeasy试剂盒分离EV，用于下游RNA或DNA提取。

NTA显示，3D培养中的EV分布更密集且尺寸更小（图5B、D）。在2D培养中，每隔6小时收集一次EV，持续48小时；在3D培养中，分别在第5、7、9、11和13天收集EV，显示3D培养在第9天EV分泌增加了三倍，而2D培养的EV分泌下降（图5A、C）。对胞外和患者血浆RNA的qRT-PCR分析显示，3D衍生的EV与宫颈癌血浆EV的RNA谱型相似度达96%，而2D培养仅与体内谱型相似度为80%。几种在3D培养和患者血浆EV中存在的miRNA在2D衍生的EV中缺失，包括癌症相关的生物标志物。通过Spearman相关分析进行的EV DNA分析显示，2D和3D培养中的EV蛋白编码基因丰度高度一致（图5E）。通过HOMER分析的非编码DNA区域显示，2D和3D衍生的EV样品高度相似，表明EV DNA含量在不同培养环境中保持稳定。

该肽水凝胶支架产生了更密集分布的小型EV，随着细胞汇合度增加分泌量增加，RNA谱型更接近体内情况。两种条件下EV DNA没有观察到差异。值得注意的是，这项研究是少数几个在多个时间点比较2D和3D培养分泌动态的研究之一。

2.2.4 Matrigel™

Matrigel™是一种包含ECM成分（如胶原IV、层粘连蛋白和纤连蛋白）的基底膜样材料，在37°C下发生凝胶化。它是应用最广泛的3D细胞培养平台之一，因为它能够支持细胞分化、迁移和类器官形成。其生物活性和易用性使其成为癌症和发展生物学中的标准工具。然而，其动物来源导致批次间变异性和生长因子浓度不明确，影响了重现性和实验控制。一项研究比较了3D Matrigel™支架和2D培养瓶中培养的原代胶质母细胞瘤（GBM）细胞产生的EV。3D细胞模型通过将GBM细胞嵌入Matrigel™并在轨道摇床上动态培养以防止附着来创建。收集培养上清液，以200×g离心5分钟，储存在-80°C。使用两种隔离技术从每个上清液样品中提取EV：沉淀（PP）和免疫亲和（IA）。对于IA，上清液离心后与磁珠混合，旋涡震荡，旋转孵育后通过磁柱多次洗涤。随后用隔离缓冲液洗脱EV。对于PP，上清液离心后与沉淀缓冲液混合，4°C孵育后再次离心。沉淀物重新悬浮于重悬缓冲液中，-80°C储存前进行最终离心。

NTA测量了EV的尺寸和浓度，结果显示两种隔离方法下，2D和3D培养的EV尺寸分布相似。然而，3D PP方法产生的EV浓度（6.03 × 10⁸ ± 1.08 × 10⁸颗粒/mL）显著高于2D IA方法（1.25 × 10⁸ ± 2.97 × 10⁷颗粒/mL）。流式细胞术确认了两种2D和3D衍生的EV中预期的四跨膜蛋白富集，CD81和CD63在约60%的分离物中存在，CD9在约20%的分离物中存在。TSG101在两种条件下的PP分离EV中约90%被检测到。此外，GBM相关标记CD44和C1QA在约30%的EV中被发现，2D和3D培养之间没有显著差异。

通过smallRNA-Seq分析EV RNA，显示无论使用何种隔离方法，3D衍生的EV中miRNA的普遍性更高。在1964个EV-miRNA中，主成分分析（PCA）清楚地区分了2D和3D培养以及两种隔离方法。十二个miRNA在3D培养中显著改变，其中九个miRNA下调，三个上调。值得注意的是，促进胶质母细胞瘤侵袭的miR-23a-3p在3D中显著上调，而对抗胶质母细胞瘤恶化的miR-7-5p则显著下调。此外，位于癌症相关DLK1-DIO3区域的四个miRNA（miR-323a-3p、miR-382-5p、miR-370-3p和miR-134-5p）也在3D EV中被识别。使用IA纯化和LC-MS/MS对六个GBM模型的EV进行蛋白质组学分析，鉴定了462种3D衍生的EV蛋白质，2D衍生的EV中有423种，共有105种。3D EV中有16种蛋白质差异表达，通路分析揭示了GTPase信号、免疫调节和应激反应通路的变化。

总体而言，3D Matrigel™支架增强了GBM细胞的EV分泌，尺寸和标记物表达与2D培养相似，同时富集了与关键GBM信号通路相关的基因组和蛋白质组货物。

2.2.5 藻酸盐

藻酸盐是一种从褐藻中提取的植物多糖，通过二价离子（如钙）的离子交联形成水凝胶。与琼脂糖一样，它具有生物相容性、无毒，并广泛应用于3D细胞培养以支持球状体形成和维持圆形细胞形态。两者都创造了非粘附性、营养渗透的环境；然而，藻酸盐的离子交联结构允许更容易溶解和更大的细胞封装和回收灵活性，而琼脂糖需要热循环进行凝胶化和溶解，限制了其与活细胞回收的兼容性。商业产品如AlgiMatrix™提供现成的高孔隙率藻酸盐支架，支持长期细胞存活并通过螯合作用实现温和回收。尽管如此，天然藻酸盐缺乏细胞粘附基序，必须进行化学修饰（例如，用RGD肽）以促进附着。一项EV研究比较了同轴生物打印藻酸盐水凝胶微纤维和2D培养皿中培养的BM-MSCs产生的EV。3D系统通过同轴挤出创建，双层同轴针头同时输送细胞悬液核心和藻酸盐溶液外壳进入3%氯化钙交联池中，引发快速凝胶化并形成中空的细胞负载微纤维。通过差速超速离心从收集的化学定义培养基中分离2D和3D培养的EV。

可调电阻脉冲传感（TRPS）显示，3D与2D培养衍生的EV尺寸没有显著差异。然而，TRPS定量显示，3D中空纤维系统使EV生产增加了1009倍，每个细胞的EV分泌量增加了约13倍。通过LC/MS进行的蛋白质组学分析显示，3D外泌体的蛋白质组学富集显著高于2D，EV样品中鉴定出1082个高丰度蛋白质，其中1023个来自3D培养，605个来自2D培养。其中，536个蛋白质共享（占49.1%），而487个蛋白质独特于3D外泌体（占44.6%），69个独特于2D外泌体（占6.3%）。3D培养衍生的外泌体富含代谢途径、核糖体功能和蛋白质加工相关的蛋白质。此外，通过管形成试验评估了两组EV的血管生成特性，其中血管内皮细胞接种在Matrigel上。2D和3D衍生的EV均显著促进了毛细管样网络的形成，表现为分支长度和节点数目的增加。

这些发现表明，基于微纤维的水凝胶不仅增强了EV的生产和蛋白质组学货物，还保持了血管生成潜力。支持这些发现的一项研究使用了海藻酸钠-透明质酸复合水凝胶，并报告称与2D培养相比，EV生产增加了约3倍。3D水凝胶衍生的EV还表现出比2D培养更显著的治疗效果，包括增强细胞增殖和迁移，减少软骨退化，并改善软骨缺损修复效果。

2.3 支架型3D模型：刚性/纤维支架

刚性或纤维支架由天然或合成材料制成，提供比水凝胶更优越的机械强度、硬度和耐磨性。其互连的孔隙和纤维结构影响营养扩散、细胞迁移、血管化和ECM沉积，使其特别适用于模拟承重组织，如骨骼、软骨和肌肉。3D打印和电纺等制造技术使其能够针对特定应用进行精确定制。然而，局限性包括传统制造方法的可重复性差、难以实现均匀孔隙分布以及不适合软组织应用。

2.3.1 合成支架

一项研究探讨了3D打印支架的结构和表面组成如何影响骨母细胞衍生EV用于骨修复的治疗潜力，并与2D培养进行了比较。钛支架具有三角形（T）或方形（S）形状和500 μm（500）或1000 μm（1000）的孔径，通过选择性激光熔化创建并涂覆纳米针羟基磷灰石（nnHA）。将MC3T3前成骨细胞（pre-OBs）和BM-MSCs接种在支架上（2 × 10⁵个细胞/支架），在8 rpm下动态培养，并在成骨培养基中孵育。通过差速离心从14天培养中分离EV，清洗并重悬于PBS中进行进一步分析。

分离的EV通过TEM分析，证实了其球形形态，与支架和2D培养的成骨细胞衍生EV一致。通过动态光散射（DLS）测量EV尺寸分布，显示平均直径约为200 nm，尽管未计算培养模型之间的尺寸差异（图6A）。通过BCA测定测量总EV蛋白浓度，通过ELISA量化CD63阳性颗粒（EV特异性标记物），两个值均归一化到细胞数量。两种培养系统的EV均表达正EV表面标记物，但ELISA显示，支架培养的CD63阳性颗粒比2D培养高出3.4倍以上（图6B）。同样，支架衍生的EV显示出蛋白含量显著增加（超过1.32倍，P ≤ 0.01）（图6C）。在3D培养变体中，T1000支架产生的CD63⁺颗粒（EV）最多，蛋白质含量最为增强。

已知影响EV生物发生的细胞内钙含量通过钙比色测定试剂盒测量，结果显示支架培养的细胞显著高于2D培养的细胞（超过9.1倍，P ≤ 0.001）（图6D），其中T100支架显示出最高水平。支架衍生EV的成骨潜力通过测量BM-MSCs中的碱性磷酸酶（ALP）活性进行评估。显著增加的ALP活性出现在3D支架的EV中，与2D培养相比，除了S1000模型外，T500-EVs诱导了最高的ALP活性（图6E）。此外，通过测量胶原蛋白生产和钙沉积评估了支架衍生EV对BM-MSCs细胞外基质形成和矿化的影响。虽然2D和3D培养之间的整体差异不具有统计学意义，但个别3D模型显示出显著变化，T500-EVs驱动了胶原水平（图6F）和钙沉积（图6G）的最大增加。最后，通过比较未涂覆和涂覆nnHA的支架评估了nnHA涂层对EV生产的影响。涂层导致成骨细胞矿化增加了2.6倍，EV生产增加了4.5倍（P ≤ 0.001）。这种增强可能是由于细胞内钙水平升高和更仿生的微环境，这两者都促进了囊泡分泌。

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