环状RNA circIGF1R通过调控碳水化合物代谢控制心脏成纤维细胞增殖

Circular RNA circIGF1R controls cardiac fibroblast proliferation through regulation of carbohydrate metabolism

摘要：过度成纤维细胞增殖和代谢重编程是病理性心脏重塑的重要特征，对心脏功能受损有显著影响。本研究探讨了环状RNA（circRNAs）在成纤维细胞代谢重编程中的作用，这是一个具有潜在治疗意义但尚未被充分研究的领域。通过对心力衰竭（HF）患者和健康个体的心脏组织进行深度circRNA测序，我们鉴定了circIGF1R（hsa_circ_0005035），其特异性地在来自衰竭心脏的分离心脏成纤维细胞中表现出失调。在源自患者的原代人心脏成纤维细胞（HCFs）中沉默circIGF1R导致加速增殖、增强的糖酵解活性、改变的葡萄糖运输以及增加的葡萄糖摄入。相反，施用重组circIGF1R抑制了HF患者HCFs中观察到的加速增殖和增强的糖酵解活性。机制上，RNA pull-down实验和计算机分析确定AZGP1为促进circIGF1R糖酵解抑制和抗增殖功能的潜在相互作用伙伴。我们的研究结果表明，circIGF1R通过代谢重编程（特别是糖酵解抑制）成为成纤维细胞增殖的关键调节因子。过表达circIGF1R在源自心力衰竭患者的心脏成纤维细胞中显示出显著的抗纤维化效果。这些结果强调了circIGF1R在通过直接靶向病理性心脏重塑中的成纤维细胞代谢来减轻心脏纤维化的治疗潜力。

引言：心血管疾病是全球死亡的主要原因，2019年占所有死亡人数的32%（世界卫生组织）。心力衰竭（HF）是一种临床综合征，其特征是心肌收缩功能受损，导致全身血液分布不足。心脏泵血功能受损源于其可忽略的再生能力，促使心脏成纤维细胞过度激活和增殖以补偿受损的心肌细胞和内皮细胞。过度的心脏纤维化导致心室僵硬和收缩力下降。几十年来，纤维化一直被认为是一个不可逆的过程。然而，最近的研究表明，靶向成纤维细胞早期增殖阶段有望开发出针对各种器官的抗纤维化疗法。

材料与方法：RNA测序和计算机验证：按照先前描述的方法制备了人类HF患者和健康对照心脏活检的总RNA和RNA文库，并进行了RNA测序。从circbase检索circRNA序列，并使用整合基因组浏览器（igv）可视化测序读数以识别潜在circRNA候选物的反向剪接连接（BSJ）。通过UCSC基因组浏览器评估circRNA候选物的同源性。

细胞培养：人的心脏成纤维细胞（HCFs）要么从PromoCell购买，要么从HF患者中分离并培养在FGM-3（FBM-3（PromoCell），补充有10% FBS（Gibco），青霉素-链霉素（100 U/ml和100 µg/ml，Gibco），1 ng/ml hbFGF（PromoCell）和5 µg/ml hINS（PromoCell））。扩增后，将HCFs分装并在Cryo-SFM（PromoCell）中冷冻保存。所有功能性实验均使用第6至9代的HCFs以避免心脏成纤维细胞衰老。进一步的处理和体外实验如补充材料所述进行。

circRNA表达的调节：circIGF1R的抑制通过转染特异性靶向circIGF1R BSJ的siRNA实现。对于所有实验，混合三种siRNA，总siRNA浓度为100 nM。Silencer™ Negative Control 1 (#4611, Ambion)用作阴性对照siRNA（NC siRNA），并使用Lipofectamine™ RNAiMAX（Invitrogen）转染siRNA。6小时后更换转染混合物为培养基，并在转染后24至72小时内收获细胞用于进一步实验。

基因表达分析：使用QIAzol（Qiagen）或miRNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA，遵循制造商协议。随后，将600至1000 ng RNA通过iScript™ cDNA合成试剂盒（BioRad）使用随机六聚体引物逆转录为cDNA，遵循制造商协议。通过使用ABsolute Blue QPCR Mix, SYBR Green, low ROX（Thermo Fisher）在ViiA7（ABI）或QuantStudio7（ABI）热循环仪中进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR），根据制造商说明量化相对RNA水平，每反应20 ng模板。目标RNA的表达水平归一化到管家基因（hsa_GAPDH, hsa_HPRT1, mmu_18s 和 mmu_Tbp），并使用ΔΔCt方法进行分析。用于qRT-PCR实验的引物对（Eurofins Genomics）列于表2。对于circRNA，设计发散引物对以扩增特定BSJ周围的区域，而mRNA转录本的引物对设计为跨内含子。

统计：使用GraphPad Prism（版本8，GraphPad）进行统计分析。使用Anderson-Darling、D’Agostino-Pearson和Shapiro-Wilk检验检查数据集的正态分布。如果数据集根据上述测试未呈正态分布，则在应用任何统计测试之前对数据进行对数转换（log10）。使用F检验、Bartlett’s检验、Brown-Forsythe检验和Spearman’s检验评估异方差性。如果数据集呈正态分布且组间方差无显著差异，则使用双尾Student’s t检验确定两组之间的统计差异。如果数据集呈正态分布且组间方差无显著差异，则通过普通单因素或双因素ANOVA确定三个或更多组之间的统计显著性。根据实验设计，通过Dunnett’s、Sidak’s或Tukey’s事后检验进行多重比较校正。所有值显示为平均值±SEM，数据展示为n = 1，如代表性数据集，和平均值±95%置信区间，数据集展示为n ≥ 3。统计显著性被认为是p ≤ 0.05。

结果：心力衰竭组织中circIGF1R的鉴定及其环状构象的验证：通过对HF患者（与健康对照相比）左心室心脏组织进行全局RNA测序，评估失调的circRNA表达模式并确定潜在的治疗靶点。总共鉴定了86,406个circRNA转录本，并通过以下条件筛选：(I) 显著差异表达（padj ≤ 0.05，FC ≥ 2），(II) 其宿主基因与心脏代谢紊乱的关联，(III) 使用整合基因组查看器进行计算机验证其BSJ，并排除那些测序读数未覆盖其BSJ的circRNA，(IV) 其物种间保守性以及(V) 在病理体内外模型中的保守性，以识别显著失调的circRNA（图1A）。这一严格的筛选流程得出circIGF1R（hsa_circ_0005035）作为我们的主要候选者（图1A）。与健康对照相比，circIGF1R在HF患者中显著上调（图1B，补充图1A）。接下来，我们通过使用发散引物进行PCR扩增来验证circIGF1R的环状构象，以扩增circIGF1R特异性BSJ周围的区域。PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳以及分离的PCR产物的Sanger测序证实了circIGF1R的封闭环结构（图1C，D）。在验证环状构象后，我们观察到circIGF1R对核酸外切酶介导的消化具有抵抗力，并且与线性对应物IGF1R（胰岛素样生长因子1）和其他mRNA分子相比具有更高的稳定性，这通过在HCFs中进行放线菌素D处理后延长的半衰期得到证明（图1E，F）。总体而言，我们从HF患者样本的RNA测序中鉴定了circRNA circIGF1R，并验证了其环状结构以及与线性RNA分子相比的延长稳定性。

图1：RNA测序鉴定circIGF1R作为HF进展的潜在调节因子。（A）通过HF活检与健康对照的RNA测序鉴定参与HF进展的circRNA的过滤策略（n = 5）。（B）来自HF活检与健康对照的circRNA测序数据集的火山图（n = 5）。截止值（虚线）设置为padj ≤ 0.05和FC ≥ 2。（C）使用发散引物创建的circIGF1R PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。M：QuickLoad® 100 bp DNA Ladder；1：HCF cDNA；2：HCF gDNA；3：NTC。（D）使用发散引物从HCF cDNA中分离的PCR产物的Sanger测序。虚线表示circIGF1R的BSJ。（E）在RNase R消化的HCF RNA中使用iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad) 反转录成cDNA后进行qRT-PCR检测 circIGF1R, IGF1R, GAPDH, GUSB 和 HPRT1 的表达水平（n = 3）。数据以百分比表示并归一化到未消化对照组。通过非配对t检验分析。（F）在HCFs中放线菌素D处理后 circIGF1R 和 IGF1R 的qRT-PCR检测。数据以倍数变化表示并归一化到0小时的表达水平。代表性实验（n = 1）来自n = 3所示。

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